Summary

Aislamiento de células Müller gliales retinianas primarias de ratón

Published: August 30, 2024
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Summary

Este manuscrito describe un protocolo detallado para aislar células de Müller gliales de la retina de ojos de ratón. El protocolo comienza con la enucleación y disección de los ojos de los ratones, seguida del aislamiento, la siembra y el cultivo de las células de Müller.

Abstract

La principal célula de soporte de la retina es la célula glial de Müller de la retina. Cubren toda la superficie de la retina y están muy cerca tanto de los vasos sanguíneos de la retina como de las neuronas de la retina. Debido a su crecimiento, las células de Müller realizan varias tareas cruciales en una retina sana, incluida la absorción y el reciclaje de neurotransmisores, compuestos de ácido retinoico e iones (como el potasio K+). Además de regular el flujo sanguíneo y mantener la barrera hematorretiniana, también regulan el metabolismo y el suministro de nutrientes a la retina. En este manuscrito se presenta un procedimiento establecido para aislar células primarias de ratón Müller. Para comprender mejor los procesos moleculares subyacentes implicados en los diversos modelos de ratón de trastornos oculares, el aislamiento celular de Müller es un enfoque excelente. Este manuscrito describe un procedimiento detallado para el aislamiento de células de Müller de ratones. Desde la enucleación hasta la siembra, todo el proceso dura unas pocas horas. Durante 5-7 días después de la siembra, no se debe cambiar el medio para permitir que las células aisladas crezcan sin obstáculos. La caracterización celular mediante morfología y distintos marcadores inmunofluorescentes es la siguiente en el proceso. Los pasos máximos para las celdas son de 3 a 4 veces.

Introduction

Las células de Müller (MC) son las principales y más abundantes células gliales que se encuentran en el tejido de la retina. Son los actores clave en el suministro de integridad estructural y funciones metabólicas dentro de la retina1. La estructura estratégica de los MC se extiende por todo el grosor de la retina, proporcionando así soporte a la retina. Además de sus propiedades de andamio, tienen funciones metabólicas para las neuronas de la retina, suministrándoles sustratos energéticos, como la glucosa y el lactato. Estas funciones son cruciales para mantener una función neuronal saludable. Se ha descrito que el deterioro de las MC contribuye a diversas enfermedades de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinopatía diabética y el glaucoma 2,3. Las MC pueden ser fuentes celulares endógenas para la terapia regenerativa en la retina1. También comprenden una porción significativa de la retina, y una fuerte evidencia sugiere que en varias especies, estas células pueden ser estimuladas para reemplazar lasneuronas faltantes. Colaboran de manera beneficiosa con las neuronas, y los extremos de las células de Müller que se ramifican cónicamente desenvainan densamente los vasos sanguíneos y conectan los componentes neuronales de la retina. Con el fin de mantener el desarrollo neuronal y la plasticidad neuronal, las células de Müller actúan como un sustrato blando para las neuronas, protegiéndolas de los traumatismosmecánicos. Además, en circunstancias patológicas, las células de Müller pueden diferenciarse en progenitores neurales o células madre que replican o regeneran los fotorreceptores y neuronas perdidos 2,3,4. Las células de Müller conservan las características de las células madre de la retina, incluyendo diferentes niveles de potencial de autorrenovación y diferenciación 5,6. La célula glial de Müller tiene un linaje retiniano significativo que produce factores neurotróficos, absorbe y recicla neurotransmisores, amortigua espacialmente los iones y mantiene la barrera hematorretiniana para mantener la retina en homeostasis 7,8,9. Esto pone de manifiesto el potencial de las células de Müller como una herramienta prometedora en las terapias basadas en células para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la degeneración de la retina. Las células de Müller son la glía principal distribuida por toda la retina, conectándose tanto con las neuronas como con los vasos sanguíneos. Desempeñan un papel protector crucial, proporcionando un soporte estructural y metabólico esencial para mantener la viabilidad y la estabilidad de las células de la retina. Desafortunadamente, se encuentran muy pocos protocolos en la literatura para el aislamiento primario de células de Müller de la retina10,11.

Presentamos un enfoque mejorado para aislar y cultivar de forma fiable células primarias de Müller de ratón. Este protocolo se utilizó en nuestro grupo para aislar células de Müller de ratones salvajes C57BL/6 y ratones transgénicos12,13. Para este protocolo se utilizan ratones de entre 5 y 11 días de edad, sin preferencia de sexo. Las celdas han sido pasadas hasta 4 veces; sin embargo, en P4 dejan de adherirse al matraz y se hace difícil cultivar un cultivo saludable. El cultivo a menudo está contaminado con células epiteliales pigmentadas de la retina (EPR), por lo que las células deben pasar al menos una vez antes de realizar cualquier experimento adicional en la línea celular. El paso permite un mayor aislamiento de los contaminantes. Por lo tanto, el protocolo presentado ofrece una forma rápida y eficaz de aislar células de Müller de ratón, que luego pueden utilizarse como una plataforma fiable para investigar dianas terapéuticas y evaluar posibles tratamientos para las enfermedades de la retina14.

Protocol

Todos los experimentos con animales se ajustaron a la declaración de ARVO para el uso de animales en la investigación oftálmica y de la visión y se realizaron siguiendo nuestro protocolo animal aprobado por el Comité del Instituto para el Cuidado y Uso de Animales (IACUC) y las políticas de la Universidad de Oakland (número de protocolo 2022-1160) 1. Preparación de medios y soluciones Prepare la solución oftálmica de células de Müller complementando el me…

Representative Results

Validación de la especificidad, pureza y función de barrera de células Müller aisladasPara confirmar la viabilidad, la morfología y las cualidades distintivas de las células de Müller aisladas, las células se examinaron bajo un microscopio óptico. Se registraron las imágenes P0 y P1 (Figura 1A). Para comprobar la contaminación de las células de Müller aisladas con células EPR y confirmar su pureza, se realizó una tinción de inmunofluorescencia (IF) utiliz…

Discussion

El aislamiento del epitelio pigmentado primario de la retina (EPR) de ratones fue documentado previamente por nuestro laboratorio. Este manuscrito describe un protocolo de demostración detallado para el aislamiento primario de células de Müller. Este procedimiento implica la enucleación, el tratamiento, la disección, la recolección, la siembra, el cultivo y la caracterización de células de Müller aisladas de ojos de ratón. Se basa en un protocolo exitoso que se encontró en publicaciones anteriores y en nuestro…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional del Ojo (NEI), el fondo R01 EY029751-04 del Instituto Nacional del Ojo (NEI). Nos gustaría agradecer a la Dra. Sylvia B. Smith, ya que este protocolo fue una versión modificada basada en su protocolo de aislamiento celular de Müller.

Materials

Beaker : 100mL KIMAX 14000
Collagenase IV  Worthington  LS004188
Disposable Graduated Transfer Pipettes :3.2mL Sterile 13-711-20
DMEM (1X)  Thermo Scientific 11885084 Media to grow Müller cells 
Fetal Bovine Serum (FBS) gibco 26140079 For complete Muller cell culture media
Glutamine synthase Cell signalling 80636
Heracell VISO 160i CO2 Incubator Thermo Scientific 50144906
Kimwipes Kimberly-Clark 34155
Luer-Lok Syringe with attached needle 21 G x 1 1/2 in., sterile, single use, 3 mL B-D 309577
Micro Centrifuge Tube: 2 mL Grainger 11L819
Pen Strep gibco 15140-122 For complete Müller cell culture media
Phosphate Buffer saline (PBS) Thermo Scientific J62851.AP
Positive Action Tweezers, Style 5/45 Dumont 72703-DZ
Scissors Iris Standard Straight 11.5cm GARANA INDUSTRIES 2595
Sorvall St8 Centrifuge ThermoScientific 75007200
Stemi 305 Microscope Zeiss n/a
Surgical Blade, #11, Stainless Steel Bard-Parker 371211
Suspension Culture Dish 60mm x 15mm Style Corning 430589
Tissue Culture Dish : 100x20mm style Corning 353003
Tornado Tubes: 15mL Midsci C15B
Tornado Tubes: 50mL Midsci C50R
Tweezers 5MS, 8.2cm, Straight, 0.09×0.05mm Tips Dumont 501764
Tweezers Positive Action Style 5, Biological, Dumostar, Polished Finish, 110 mm OAL Electron Microscopy Sciences Dumont 50-241-57
Underpads, Moderate : 23" X 36" McKesson 4033
Vannas Spring Scissors – 2.5mm Cutting Edge FST 15000-08
Vimentin  invitrogen MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2 Zeiss n/a
Zeiss Zen Blue 2.6 Zeiss n/a

Referencias

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Citar este artículo
Tomaszewski, R., Gad, M. S., Negoita, P., Abdelkarim, R., Tawfik, A. Isolation of Primary Mouse Retinal Glial Müller Cells. J. Vis. Exp. (210), e66237, doi:10.3791/66237 (2024).

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