链霉亲和素亲和网格制备用于冷冻电子显微镜样品制备

1.试剂的制备 在结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5,150 mM KCl，5 mM EDTA，10%海藻糖）中将商业购买的链霉亲和素稀释至终浓度为0.5 mg/mL。确保最终海藻糖浓度为 10%。在液氮中快速冷冻25-50μL的等分试样，并储存在-80°C。 将 1,2-二棕榈酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-N-（生物素基）钠盐溶解在 65：35：8 v/v/v 氯仿/甲醇/水溶剂中，最终脂质浓度为 1 mg/mL。将20-30μL的一次性等分试样储存在-80°C的玻璃小瓶中。注意：如果按重量进行，溶剂的制备更准确。首先，将 1.85 g 超纯水与 6.41 g 高效液相色谱 （HPLC） 级甲醇混合，并将其加入 22.42 g 氯仿中以制备溶剂。注意：在开始本协议之前，请阅读并理解制造商的安全数据表以及氯仿和甲醇有机溶剂处理和处置的推荐说明。避免甲醇与皮肤直接接触。 2. 网格的预处理 将碳箔浸入 100% 氯仿中两次，浸入 100% 乙醇中一次，在金网格上清洗碳箔。将网格放在干净的滤纸上晾干。重复洗涤过程，总共三个周期。注意：市售碳箔网格具有 10-12 nm 厚碳的碳膜（参见材料列表），孔径范围为 0.6-2 μm，已取得了可重复的成功。按照鲁宾斯坦实验室的纳米加工协议14 制备的市售金箔网格和自制的霍利碳网格也已成功使用。使用具有较薄碳膜的市售网格获得的可重复性较低的结果。不要使用铜网格，因为铜会与样品中可能存在的任何有机胺发生反应。 网格干燥后，将 2.5-5 nm 厚的碳层蒸发到有孔碳网格的碳侧。碳厚度通过石英晶体膜厚度测量进行控制，该测量内置于 材料表 文件中提供的碳蒸发器中。 让新蒸发的碳老化（即变得更疏水）1周。 3.链霉亲和素晶格的制备 注意：为了在holey-carbon EM网格上生长2D链霉亲和素晶体，首先，通过Langmuir-Schaefer转移将生物素化的脂质单层施加到碳膜的孔（图1B）上。脂质单层按照后续步骤形成（图2）。滑石粉在蓖麻油和培养皿之间形成边界，当脂质单层形成时，一层薄薄的蓖麻油有助于保持恒定的表面压力。含有步骤2.2中蒸发的碳的一面用于拾取单层，用结晶缓冲液洗去多余的脂质，并将链霉亲和素溶液孵育在网格上进行结晶。 用 70% 乙醇清洁工作台区域。 用氯仿冲洗 5 μL 玻璃注射器数次以清洁。使用前让注射器完全干燥。 再次清洗碳蒸发的网格，即在使用前，将它们浸入 100% 乙醇中。让网格在干净的滤纸上干燥。 当网格干燥时，用 100% 氯仿和 100% 乙醇清洗每个抗毛细管镊子。让镊子完全干燥。 在石蜡膜的清洁面，为将要制作的每个网格准备三滴 50 μL 结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、150 mM KCl、5 mM EDTA、10% 海藻糖）。 用结晶缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5,150 mM KCl，5 mM EDTA，10%海藻糖）填充35mm无涂层培养皿的盖子。用镜头纸清洁表面。 在培养皿的周边撒上科学级滑石粉。随后，这可作为下一步蓖麻油扩散程度的指标。加入足够的滑石粉以形成屏障，保护蓖麻油不接触培养皿的边缘。添加过多的滑石粉会限制制造脂质单层的可用空间。 将 200 μL 移液器吸头浸入蓖麻油中，以获得悬挂在移液器吸头上的中等大小的液滴（约 20 μL）。将该液滴接触培养皿中缓冲液的表面，在那里它将扩散形成均匀的薄膜。由此产生的油薄膜用作活塞15，当脂质单层形成时，活塞15保持恒定的表面压力（步骤3.10）。注意：添加足够的蓖麻油而不是太少很重要，最好添加一滴。在制作脂质单层之前，让蓖麻油充分扩散。 在取样试样使用之前，用溶解的脂质冲洗 5 μL 玻璃注射器一到两次。避免在填充注射器的脂质中产生气泡。注意：用溶解的脂质冲洗玻璃注射器，以防步骤3.2残留任何残留的氯仿。残留的氯仿会影响所得单层的质量。 从注射器中分配尽可能小体积（~0.5μL）的脂质，然后轻轻接触悬挂的液滴到蓖麻油膜的表面。请注意，脂质溶液在接触点突破蓖麻油膜，所得脂质单层在蓖麻油薄膜的中心形成一个圆圈。依次添加几滴脂质或在制作一些网格后添加更多脂质，但如果添加过多，脂质会扩散到蓖麻油的边界并扩散到滑石粉和任何污染表面活性剂被隔离的周边。如果发生这种情况，则需要重新启动该过程。 拿起带有防毛细管镊子的网格，使镊子的直臂和网格的碳蒸发侧都面向单层。 通过将网格的碳蒸发侧接触到单层 1-2 秒，将单层的一部分转移到多孔碳中。注意：网格表面变得亲水，导致缓冲液的薄球形帽在从培养皿中取出后覆盖整个网格，表明转移成功。 将现在粘附在网格上的缓冲液的球形盖按顺序接触，每个1秒，到步骤3.5中在封口膜上制备的三滴50μL结晶缓冲液上。注意：此步骤试图尽可能多地去除覆盖球帽表面（而不是以前的疏水碳膜）的多余脂质，以避免在电子显微镜下观察样品时形成脂质囊泡。 小心地将 4 μL 0.5 mg/mL 链霉亲和素加入网格上剩余的结晶缓冲液球盖中。 将网格放入湿度室中。对整批网格重复步骤 3.11-3.14。 在室温（RT）下将网格在湿度室内孵育2小时，以避免蒸发。注意：重要的是，在应用单层后，网格的金色面在任何时候都不会变湿。 孵育2小时后，为石蜡膜清洁侧的每个网格准备一滴300μL冲洗缓冲液（10mM HEPES，pH 7.5,50mM KCl，5mM EDTA，10%海藻糖）。注意：冲洗缓冲液含有50mM KCl，而不是150mM KCl，后者位于用于步骤3.5-3.6的结晶缓冲液中。 通过将网格放在 300 μL 冲洗缓冲液滴上来洗涤多余的（未结合）链霉亲和素。一次对一个网格执行步骤 3.18-3.20。避免将网格长时间留在 300 μL 冲洗缓冲液滴上。注意：只进行一次洗涤，因为此时链霉亲和素晶体/单层很脆弱。每当将网格从一滴洗涤缓冲液的表面抬起时，网格和洗涤液滴之间的液体桥就会破裂。在破裂时，瞬态压力梯度（吸入压力）施加到跨越碳膜开孔的自支撑单层晶体上。预计这种吸入压力会导致单层晶体的瞬态穹顶，并伴随着晶体覆盖区域的膨胀。如果面积的增加超过晶体的弹性极限，晶体可能会破裂或变得无序。 立即用无绒擦拭擦拭器擦干防毛细管镊子，以方便在下一步中将网格释放到滤纸上。通过将抗毛细管镊子的扭结臂插入液滴中，捡起漂浮在冲洗缓冲液滴上的网格。 用滤纸从侧面轻轻吸干多余的缓冲液。将网格放在滤纸上，金色面朝下，对每个网格重复步骤3.18-3.20，并让网格干燥15-20分钟。 网格干燥后，将它们翻转过来，使金色的一面现在朝上。将一层薄薄的碳（约 0.5-2 nm 厚）蒸发到网格的金色一侧。注意：将网格存储在恒定湿度下，其值似乎无关紧要，请注意，相对湿度的多次变化预计会导致膨胀和收缩的循环。在使用冷冻电镜之前，让网格老化 1 周以获得最佳效果，因为网格背面的疏水性对于单层稳定性可能很重要。网格在很长一段时间内都是稳定的，但3个月后，背面的碳可能会变得不那么疏水。 4. 通过阴性染色检查链霉亲和素亲和力网格批次质量 在封口膜的清洁面准备两滴 50 μL 和一滴 100 μL 样品缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP）。 通过接触两个 50 μL 滴剂去除海藻糖并重新水化链霉亲和素网格，让网格漂浮在 100 μL 样品缓冲液液滴上 10 分钟。注意：最好避免在补水和随后的样品结合孵育期间使用洗涤剂。缓冲液将分散到网格的金侧，并限制洗涤效率以去除多余的样品。 补水后，用抗毛细管镊子将网格捡起，使抗毛细管镊子的扭结臂在滴落中。 轻轻吸干多余的缓冲液，然后快速重新涂抹 4 μL 75-100 nM 样品（可选）。注意： 避免在补水后让网格干燥。 将样品在湿度室中孵育1-5分钟。注意：浓度和孵育时间将取决于样品，应进行优化。提供的样品浓度和孵育时间是建议的起点。 在封口膜的清洁面，设置四滴 30 μL 样品缓冲液和 1% 甲酸铀 （UF） 染色剂。注意： 在执行此步骤之前，请阅读并理解制造商的安全数据表以及处理和处置甲酸铀的建议说明。甲酸铀酰是一种有毒的放射性化合物。确保事先获得机构批准才能使用放射性物质。 通过触摸四滴样品缓冲液中的每一滴来洗掉未结合的样品。 使用UF的标准负性染色程序对样品进行染色。轻轻吸干侧面的 UF 污渍，在网格上留下一层非常厚的污渍。如果需要，可以在印迹后将额外的 0.5 μL 染色剂涂抹在网格上，以使染色剂变厚。让网格风干。注意：由于链霉亲和素网格非常亲水，负染色往往会在任何地方形成非常均匀的薄膜，这与使用经过辉光放电处理的连续碳网格时常见的情况相反。因此，建议留下较厚的染色剂薄膜。 5. 用生物素化样品冷冻链霉亲和素亲和力网格 注意：以下程序适用于包含内部印迹传感器的单侧自动柱塞（也可以在其他自动插入设备中进行单侧手动印迹） 在封口膜的清洁面上制备两滴 50 μL 和一滴 100 μL 样品缓冲液（例如，50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP）。 通过接触两个 50 μL 液滴来重水化链霉亲和素网格，并让网格漂浮在 100 μL 样品缓冲液液滴上 10 分钟。 补水后，用抗毛细管镊子将网格捡起，使抗毛细管镊子的扭结臂在滴落中。 轻轻吸干多余的缓冲液，然后快速加入 4 μL 75-100 nM 样品。 将样品在湿度室中孵育1-5分钟。注意：同样，浓度和孵育时间将取决于样品，应进行优化。提供的样品浓度和孵育时间是建议的起点。对于低浓度的样品，可以孵育更长的时间和/或将样品与网格结合多次。 在石蜡膜的清洁面上准备两滴 10 μL 冷冻缓冲液（例如，50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3% 海藻糖、0.01% NP40）。孵育后，通过将网格接触冷冻缓冲液的第一滴来洗涤未结合的样品。将网格放到冷冻缓冲液的第二滴上。 用镊子连接到单侧自动柱塞上，快速抓住网格的边缘。轻轻吸干多余的缓冲液，然后快速将 4 μL 冷冻缓冲液（50 mM HEPES pH 7.5、50 mM KCl、0.5 mM TCEP、3% 海藻糖、0.01% NP40）施加到网格上。 将镊子连接到单侧自动柱塞上。使用印迹传感器可检测网格上的液滴，印迹时间在 4-6 秒之间，可获得最佳结果。条件会因所使用的样品和缓冲液而异。 6. 从链霉亲和素亲和力网格中收集的冷冻电镜电影的数据处理 链霉亲和素亲和素亲和网格的数据采集可以像标准网格一样进行，无需特殊的显微镜调整。然而，此处详述的程序仅在显微照片的运动校正后去除链霉亲和素信号。因此，依赖原始电影帧的数据处理步骤（例如粒子抛光）无法可靠地执行。链霉亲和素信号减法（除 CTF 估计外，所有标准下游处理都需要）需要在 Linux 环境中运行的 Matlab 版本 R2014b 或更高版本。信号减法依赖于链霉亲和素层的结晶性质，这允许峰掩蔽，从而从每个显微照片的傅里叶变换中去除信号。 设置处理脚本将“补充文件”中的所有文件复制到项目目录中的专用文件夹中 准备一个名为 processing_scripts 的目录，其中包含以下文件：lsub.m （补充编码文件 1;减法脚本）process_subtration.sh （补充编码文件 2;循环所有可用显微照片、生成并行作业并跟踪输入和输出的包装脚本）process_subtraction.cfg （补充编码文件 3;包含减法作业参数的配置文件，请参见 6.2） 准备一个名为 support_scripts 的目录，其中包含以下文件：bg_drill_hole.m（补充编码文件 4）bg_FastSubtract_standard.m（补充编码文件 5）bg_Pick_Amp_masked_standard.m（补充编码文件 6）bg_push_by_rot.m（补充编码文件 7）ReadMRC.m（补充编码文件 8）WriteMRC.m（补充编码文件 9）WriteMRCHeader.m（补充编码文件 10） 根据需要调整配置文件（process_subtraction.cfg，（参见 图 3）：输入：包含 mrc 格式的运动校正显微照片的目录的路径。使用包含通配符 （？， *） 的目录或模式。例：输入=“/路径/到/project_directory/micrographs/”或输入=“/路径/到/project_directory/micrographs/*.mrc” output_dir：格子减去显微照片应写入的目录的路径。 only_do_unfinished：指定 （true|false） 是否应覆盖或跳过预先存在的减去显微照片。此参数可用于在显微镜会话中间启动晶格减法脚本（默认值：true）。 num_parallel_jobs：指定并行作业数。此数字取决于用于处理的硬件规格，不应高于可用内核数。在具有 32 个内核和一个网络文件系统的系统上，通过 14 个并行作业实现了最佳性能。为获得最佳性能，请使用显微照片子集优化此值。 Pad_Origin_X：纵向（图像宽度图像高度）的K3探测器为1000。FFT 在方形盒子中执行，如果探测器具有非方形尺寸，则需要填充。 Pad_Origin_Y：纵向 K3 探测器（图像宽度图像高度）时为 200。 请勿更改 Inside_Radius_Ang （90） 和 Outside_Radius_Ang （3.0）。晶格减法在两种分辨率之间执行（单位为埃）。 Pixel_Ang：以浮点值的形式提供像素大小。 阈值：减去阈值截止值，以将格子替换为傅里叶空间中的背景。成功使用的值介于 1.4-1.6 之间。使用 1.42 作为起点。 请勿更改 expand_pixel （10） 和 pad_out_opt （0）。expand_pixel 是一个直径值，用于在值高于阈值截止值的像素周围进行遮罩。pad_out_opt 是一个选项，用于决定输出中是否包含填充区域。 addpath_m：支持脚本的路径。 path_to_matlab_bin：系统的 Matlab 安装箱目录的路径。 path_matlab_script：上面在步骤 6.1.2 下复制的 matlab 减法脚本 （lsub.m） 的路径。 保存修改后的脚本后，运行脚本 （bash ./process_subtraction.sh ） 以从输入显微照片中减去链霉亲和素信号。如果参数 only_do_unfinished 设置为 true，则可以中断和/或重新启动脚本（请参阅步骤 6.2.3）。如果发生错误，请查看 bash 脚本中指定的参数。确保参数变量与其赋值之间没有意外的空格，因为这是常见的错误来源。 使用晶格减去的图像进行标准冷冻电镜图像处理。