Este protocolo describe una prueba de biomarcadores de orina sintética multianalito mediada por CRISPR-Cas que permite el diagnóstico del cáncer en el punto de atención a través del análisis ex vivo de las actividades de la proteasa asociadas al tumor.
La creación de biomarcadores sintéticos para el desarrollo de diagnósticos de precisión ha permitido la detección de enfermedades a través de vías más allá de las utilizadas para las mediciones tradicionales de biofluidos. Los biomarcadores sintéticos generalmente hacen uso de reporteros que proporcionan señales legibles en el biofluido para reflejar las alteraciones bioquímicas en el microambiente local de la enfermedad durante la incidencia y progresión de la enfermedad. La concentración farmacocinética de los reporteros y la amplificación bioquímica de la señal de la enfermedad son primordiales para lograr una alta sensibilidad y especificidad en una prueba diagnóstica. Aquí, se construye una plataforma de diagnóstico de cáncer utilizando un formato de biomarcadores sintéticos: nanosensores basados en la actividad que llevan reporteros de ADN estabilizados químicamente que pueden ser liberados por firmas proteolíticas aberrantes en el microambiente tumoral. El ADN sintético como indicador de enfermedades ofrece la capacidad de multiplexación a través de su uso como código de barras, lo que permite la lectura de múltiples firmas proteolíticas a la vez. Los reporteros de ADN liberados en la orina se detectan utilizando nucleasas CRISPR a través de hibridación con ARN CRISPR, que a su vez producen una señal fluorescente o colorimétrica tras la activación enzimática. En este protocolo, se construyen nanosensores basados en la actividad y con código de barras de ADN, y su aplicación se ejemplifica en un modelo de ratón preclínico de cáncer colorrectal metastásico. Este sistema es altamente modificable de acuerdo con la biología de la enfermedad y genera múltiples señales de enfermedad simultáneamente, lo que permite una comprensión integral de las características de la enfermedad a través de un proceso mínimamente invasivo que solo requiere la administración de nanosensores, recolección de orina y una prueba en papel que permite el diagnóstico en el punto de atención.
A pesar del importante esfuerzo realizado para identificar biomarcadores tumorales, como las proteínas de excreción y el ADN, el campo del diagnóstico del cáncer se ha visto afectado por su baja abundancia o rápida degradaciónen la circulación. Como estrategia complementaria, los biomarcadores sintéticos de bioingeniería que responden selectivamente a las características de la enfermedad para generar señales amplificadas representan nuevas vías hacia diagnósticos precisos y accesibles 2,3. Para ayudar a la detección, estos biomarcadores sintéticos aprovechan los mecanismos de activación dependientes del tumor, como la amplificación enzimática, para producir analitos con una mejor relación señal-ruido4. Aquí, una clase de enzimas asociadas al cáncer, las proteasas, se aprovechan para activar sensores inyectables a nanoescala para liberar indicadores de enfermedades detectables en los biofluidos como la sangre o la orina 5,6. A la luz de la heterogeneidad tumoral, el desarrollo de un panel de sensores activados por proteasa permite realizar pruebas multianalito que combinan diferentes eventos de escisión de proteasas en una “firma de enfermedad” para evaluar la incidencia y la progresión del cáncer de una manera más específica y multiplexada.
Se han desarrollado biomarcadores sintéticos activados por proteasa que comprenden sustratos peptídicos conjugados con la superficie de un portador inerte7. Cuando se inyectan in vivo, estos péptidos son transportados al tumor, tras lo cual la escisión enzimática por las proteasas tumorales libera reporteros en la sangre o la orina para su detección. La detección multiplexada con biomarcadores sintéticos activados por proteasa requiere que cada biomarcador sintético dentro de un cóctel se etiquete con un código de barras molecular único. Con este fin, se han desarrollado varios enfoques, incluidos los códigos de barras de masa y los reporteros codificados por ligandos 8,9,10. A diferencia de estos métodos de multiplexación, que pueden limitarse a unas pocas posibilidades de señal diferentes, el código de barras de ADN ofrece muchas más combinaciones de acuerdo con la alta complejidad y heterogeneidad de los estados de enfermedad humanos. Para ampliar la multiplexidad de los biomarcadores sintéticos, los sensores tienen un código de barras etiquetando cada reportero con una secuencia de ADN única para su detección a través de la nucleasa CRISPR-Cas para amplificar la señal biofluídica ex vivo. Estos códigos de barras de ADN monocatenario (ssDNA) están diseñados para unirse a ARN guía CRISPR (crRNA) complementarios, activando la actividad de la nucleasa colateral activada por el objetivo de CRISPR-Cas12a11. Esta actividad nucleasa se puede emplear para escindir una cadena de ADN reportera detectada a través de la cinética de fluorescencia o utilizando tiras de papel.
Además de la amplificación molecular a través de proteasas (in vivo) y CRISPR-Cas (ex vivo), otra característica clave del diseño de los biomarcadores sintéticos activados por proteasa consiste en aprovechar la farmacocinética de nanomateriales para aumentar la concentración de señales diagnósticas en biofluidos10. Un enfoque es el uso de un portador de nanopartículas para aumentar el tiempo de circulación de sustratos peptídicos conjugados en superficie. Se selecciona un dendrímero de polietilenglicol (PEG) como nanotransportador con un diámetro hidrodinámico relativamente pequeño y multivalencia para aumentar la administración a los tumores. Si bien es lo suficientemente pequeño como para promover la entrega del tumor, el tamaño del portador de PEG es mayor que el límite de tamaño de ~ 5 nm de la barrera de filtración glomerular del riñón, de modo que solo los sustratos peptídicos escindidos pueden eliminarse en la orina, aprovechando la filtración de tamaño por parte de los riñones12. En este protocolo, se describe el flujo de trabajo de varios pasos para la síntesis y aplicación de nanosensores basados en actividad con código de barras de ADN en un modelo murino preclínico, destacando la configuración de la prueba de biomarcadores de orina sintética multianalito mediada por CRISPR-Cas, que ha sido empleada por este grupo para clasificar el estado de la enfermedad en modelos murinos de múltiples tipos de cáncer13. Gracias al principio de diseño versátil, los tres componentes funcionales del nanosensor -el nanoportador (polímero PEG), el módulo sensible a estímulos (sustrato activado por proteasa) y el reportero biofluídico (código de barras de ADN)- pueden intercambiarse con precisión según las necesidades específicas de la aplicación, lo que permite la modularidad adaptando las especificidades del objetivo y la liberación.
Aquí se presenta una plataforma altamente personalizable para la detección multiplexada del cáncer con una prueba de orina portátil que evalúa la actividad proteolítica asociada a la enfermedad mediante un sensor inyectado mínimamente invasivo. Cuando es activada por las proteasas tumorales, la escisión del sustrato peptídico se amplifica a través de la liberación de códigos de barras de ADN en la orina. Los reporteros de ADN sintético en una muestra de orina se pueden leer mediante una amplificaci?…
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue financiado en parte por una subvención de apoyo del Instituto Koch número P30-CA14051 del Instituto Nacional del Cáncer (Centro de Biotecnología Swanson), una subvención del Centro Central P30-ES002109 del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental, el Centro Marble para la Nanomedicina del Cáncer del Instituto Koch, el Programa de Investigación de Frontera del Instituto Koch a través del Fondo de Investigación del Cáncer Kathy y Curt Marble, y el Fondo Virginia y D. K. Ludwig para la Investigación del Cáncer. A.E.V.H. cuenta con el apoyo de una beca de capacitación predoctoral (T32GM130546) financiada por los NIH. S.N.B. es investigador del Instituto Médico Howard Hughes. L.H. cuenta con el apoyo de un premio K99/R00 Pathway to Independence Award del Instituto Nacional del Cáncer y la financiación inicial de la Universidad de Boston.
10x NEB Buffer 2.1 | New England Biolabs | B6002SVIAL | |
20-mer phosphorothioated DNA reporters with 3’-DBCO group | IDT | Custom DNA | |
Agilent 1100 High Performance Liquid Chromatography system with Vydac 214TP510 C4 column | Agilent | HPLC | |
ÄKTA fast protein liquid chromatography (FPLC) | GE Healthcare | FPLC | |
Amicon ultracentrifuge tubes (MWCO = 10 kDa) | EMD millipore | Various volumes available | |
Azide-terminated PAPs with C-terminus cysteine | CPC Scientific | Custom peptide | |
crRNAs | IDT | See Supplementary Table 1 | |
Cryogenic transmission electron microscopy | JEM-2100F | JEOL | cyroTEM |
Cysteine terminated DNA-peptide conjugates | CPC Scientific | Custom peptide | |
Dynamic light scattering (DLS) | DLS | ||
EnGen LbaCas12a (Cpf1), 100 µM | New England Biolabs | M0653T | |
Experimental animals | Taconic Biosciences | BALB/cAnNTac | 6–8 weeks of age |
gentleMACS C tubes | Miltenyi Biotec | 130-093-237 | tissue homogenization |
HybriDetect Universal Lateral Flow Assay Kit | Miltenyi Biotec | MGHD 1 | |
Matrix-assisted laser desorption/ionization–time of flight (MALDI–TOF) mass spectrometry | Bruker | Microflex MALDI–TOF | |
MC26-Fluc cell line | Kenneth K. Tanabe Laboratory, Massachusetts General Hospital | ||
multivalent PEG (40 kDA, 8-arm) with maleimide-reactive group | JenKem | A10020-1 / 8ARM(TP)-MAL-40K,1 g | |
Python, Version 3.9 | https://www.python.org/ | ||
Quant-iT OliGreen ssDNA Assay Kit and Quant-iT OliGreen ssDNA Reagent | Invitrogen | O11492 | ssDNA assay kit |
ssDNA FAM-T10-Quencher and FAM-T10-Biotin reporter substrates | IDT | Custom DNA | |
Superdex 200 Increase 10/300 GL column | GE Healthcare | GE28-9909-44 | For FPLC |
Tecan Infinite Pro M200 plate reader | Tecan | ||
ThermoFisher Pierce BCA Protein Assay Kit | ThermoFisher Scientific | 23225 |