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Medicina

Efecto antagónico de Jiawei Shengjiang San en un modelo de rata de nefropatía diabética: relacionado con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1

Published: May 10, 2024
doi:
10.3791/66179
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1Graduate School,Hebei University of Chinese Medicine, 2School of Basic Medical Sciences,Hebei University of Chinese Medicine, 3Department of Endocrinology and Nephrology, Renal Research Institute of Beijing University of Chinese Medicine,Dongzhimen Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 4Hebei Province Academy of Chinese Medicine Sciences, 5Department of Nephrology, First Affiliated Hospital,Hebei University of Chinese Medicine

Summary

Aquí, presentamos un protocolo que describe la farmacología de redes y las técnicas de acoplamiento molecular para explorar el mecanismo de acción de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) en el tratamiento de la nefropatía diabética.

Abstract

Nuestro objetivo fue profundizar en los mecanismos que subyacen a la acción de Jiawei Shengjiang San (JWSJS) en el tratamiento de la nefropatía diabética y en el despliegue de la farmacología de red. Empleando técnicas de farmacología de redes y acoplamiento molecular, predijimos los componentes activos y las dianas de JWSJS y construimos una meticulosa red de “fármaco-componente-diana”. Se utilizaron análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO) y de la enciclopedia de genes y genomas de Kioto (KEGG) para discernir las vías terapéuticas y los objetivos del JWSJS. Se implementó Autodock Vina 1.2.0 para la verificación del acoplamiento molecular, y se realizó una simulación de dinámica molecular de 100 ns para confirmar los resultados del acoplamiento, seguida de una verificación en animales in vivo . Los hallazgos revelaron que JWSJS compartía 227 objetivos que se cruzaban con la nefropatía diabética, construyendo una topología de red de interacción proteína-proteína. El análisis de enriquecimiento de KEGG denotó que JWSJS mitiga la nefropatía diabética mediante la modulación de los lípidos y la aterosclerosis, la vía de señalización PI3K-Akt, la apoptosis y la vía de señalización HIF-1, con la proteína quinasa 1 activada por mitógenos (MAPK1), MAPK3, el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) y la serina/treonina-proteína quinasa 1 (AKT1) identificados como objetivos colectivos de múltiples vías. El acoplamiento molecular afirmó que los componentes centrales de JWSJS (quercetina, ácido palmitoleico y luteolina) podrían estabilizar la conformación con tres objetivos fundamentales (MAPK1, MAPK3 y EGFR) a través de enlaces de hidrógeno. Los exámenes in vivo indicaron un aumento notable del peso corporal y reducciones de las proteínas séricas glicosiladas (GSP), el colesterol de lipoproteínas de baja densidad (LDL-C), el trifosfato de uridina (UTP) y los niveles de glucosa en sangre en ayunas (FBG) debido al JWSJS. La microscopía electrónica junto con la hematoxilina y la eosina (HE) y la tinción con ácido peryódico-Schiff (PAS) destacaron el potencial de cada grupo de tratamiento para aliviar el daño renal en diversos grados, exhibiendo disminuciones variadas en p-EGFR, p-MAPK3/1 y BAX, e incrementos en la expresión de BCL-2 en los tejidos renales de las ratas tratadas. En conclusión, estos conocimientos sugieren que la eficacia protectora de JWSJS en la nefropatía diabética podría estar asociada con la supresión de la activación de la vía de señalización EGFR/MAPK3/1 y el alivio de la apoptosis de las células renales.

Introduction

La diabetes mellitus (DM) es una enfermedad crónica que afecta a múltiples sistemas y puede causar diversas complicaciones debido a la hiperglucemia continua, como la nefropatía diabética (DN), la retinopatía y la neuropatía1. La DN es una complicación grave de la DM, que representa alrededor del 30-50% de la enfermedad renal terminal (IRCT)2. Su manifestación clínica es la microalbuminuria, que puede progresar a IRCT caracterizada por aumento del volumen glomerular, hiperplasia del estroma mesangial y engrosamiento de la membrana basalglomerular 3. La patogenia de la DN es compleja y no ha sido completamente dilucidada. Los métodos clínicos, como la disminución de la glucosa en sangre, la regulación de la presión arterial y la reducción de la proteinuria, se utilizan principalmente para retrasar su progreso, pero el efecto es general.

En la actualidad, no se ha encontrado ningún fármaco específico para tratar la DN4. Sin embargo, durante siglos, las hierbas medicinales chinas han sido ampliamente utilizadas en el tratamiento de la DM y sus complicaciones5 y han mejorado los síntomas clínicos de los pacientes y retrasado la progresión de la enfermedad. Debido a las ventajas de los efectos multicomponente, multiobjetivo y multivía, se espera que las hierbas medicinales chinas sean una fuente de fármaco innovadora para el tratamiento de la DN6.

“Shengjiang san” se originó a partir del “Wanbing Huichun” del médico de la dinastía Ming Gong Tingxian. El libro “Neifu Xianfang” describe el uso de Bombyx Batryticatus, Cicadae Periostracum, Curcumaelongae Rhizoma y Radix Rhei et Rhizome. En base a esto, después de agregar Hedysarum Multijugum Maxim, Epimrdii Herba y Smilacis Glabrae Rhixoma, ejerce la función de shengjiang san de aumentar la lucidez, disminuir la turbidez, liberar el “calor” estancado y armonizar el “qi” y la sangre 7,8. También aumenta el efecto de fortalecer el bazo y tonificar los riñones. Su eficacia es consistente con la patogenia del “qi” de DN para subir y bajar de orden debido a la deficiencia de “energía vital”, sequedad excesiva y “calor”, y estancamiento del “calor” causado por un triple energizante 7,8.

Estudios clínicos previos han demostrado que las hierbas medicinales chinas se han utilizado para tratar la DM y sus complicaciones, y se ha demostrado que el jiawei shengjiang san (JWSJS) regula la glucosa y los lípidos en sangre, reduce la proteinuria y mejora significativamente la eficacia clínica de los pacientes con DN temprano7. La capacidad de JWSJS para reducir los niveles de proteína urinaria y glucosa en sangre en ratas DN ha sido confirmada por estudios previos. Esto probablemente sucede mediante la inhibición de las vías de señalización TXNIP/NLRP3 y RIP1/RIP3/MLKL, reduciendo la piroptosis de podocitos y previniendo la apoptosis necrótica en los tejidos renales de ratas DN, logrando así la protección renal9. El JWSJS puede aumentar la expresión de la nefrina y la proteína podocina y reducir la lesión de los podocitos en ratas DN, lo que sugiere que el JWSJS tiene un efecto inhibidor sobre la lesión de los podocitos. El JWSJS tiene un cierto efecto anti-DN con buenos perfiles de seguridad, pero hay poca investigación al respecto, y este trabajo se centra principalmente en la piroptosis y la apoptosis necrótica. La literatura no es lo suficientemente profunda ni sistemática10. Nuestros hallazgos previos han confirmado que el JWSJS puede reducir la proteinuria y aliviar el daño renal en ratas DN7. Sin embargo, existen pocos estudios sobre el mecanismo del JWSJS para el tratamiento de la DN, y estos carecen de profundidad y sistematización. Por lo tanto, este estudio tiene como objetivo analizar las sustancias moleculares y los mecanismos de acción de JWSJS para el tratamiento de la DN utilizando farmacología en red y proporcionar una base sólida para futuras investigaciones.

La farmacología de redes es un método emergente para estudiar el mecanismo de acción de los fármacos, incluyendo la quimioinformática, la biología de redes, la bioinformática y la farmacología11,12. El diseño de la investigación en farmacología en red es bastante similar al concepto holístico de la medicina tradicional china13,14, y es un método importante para estudiar el mecanismo de las hierbas medicinales chinas. El acoplamiento molecular puede estudiar las interacciones entre moléculas y predecir sus patrones de unión y afinidad. El acoplamiento molecular se ha convertido en una técnica crítica en el campo de la investigación farmacológica asistida por ordenador15. Por lo tanto, este estudio construyó una red de interacción JWSJS-DN-diana a través de métodos de farmacología de red y acoplamiento molecular que ofrece una base teórica y confiable para una mayor exploración del tratamiento de DN con JWSJS.

Protocol

Todos los animales fueron mantenidos y utilizados de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de los Estados Unidos para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio,8ª Edición, y fueron reportados como se recomienda en las guías ARRIVE16,17. El estudio se llevó a cabo de acuerdo con la Guía del Consejo Nacional de Investigación de China para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y fue apr…

Representative Results

Siguiendo el protocolo, finalmente se obtuvieron 90 ingredientes activos de JWSJS del análisis después del cribado y la deduplicación de acuerdo con los estándares establecidos de OB y DL. Estos incluían 20 tipos de Hedysarum Multijugum Maxim, 23 tipos de Epimrdii Herba, 15 tipos de Smilacis Glabrae Rhixoma, 16 tipos de Radix Rhei et Rhizome, cuatro tipos de Curcumaelongae Rhizoma, 15 tipos de Cicadae Periostracum y seis tipos de…

Discussion

Nuestro estudio empleó una combinación de farmacología de red, acoplamiento molecular y modelos animales in vivo . Un paso crítico fue el establecimiento de la red “farmaco-componente-diana”, que fue crucial para identificar los mecanismos potenciales de JWSJS en el tratamiento de la DN, centrándose particularmente en su interacción con la vía de señalización EGFR/MAPK3/1.

Durante este estudio, hicimos varias modificaciones, particularmente e…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por el proyecto general de la Fundación de Ciencias Naturales de la Provincia de Hebei, China (No. H2019423037).

Materials

2×SYBR Green qPCR Master Mix  Servicebio, Wuhan, China G3320-05
24-h urine protein quantification (UTP) Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering N/A
3,3'-Diaminobenzidine Shanghai Huzheng Biotech, China 91-95-2
Automatic biochemical analysis instrument Hitachi, Japan 7170A
Anhydrous Ethanol Biosharp, Tianjin, China N/A
BAX Primary antibodies  Affinity, USA AF0120 Rat
BCL-2 Primary antibodies  Affinity, USA AF6139 Rat
BX53 microscope Olympus, Japan BX53
Chloroform Substitute ECOTOP, Guangzhou, China ES-8522
Desmond software  New York, NY, USA Release 2019-1
Digital Constant Temperature Water Bath Changzhou Jintan Liangyou Instrument, China DK-8D
EGFR Primary antibodies  Affinity, USA AF6043 Rat
Embed-812 RESIN Shell Chemical, USA 14900
Fasting blood glucose (FBG) Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering N/A
FC-type full-wavelength enzyme label analyser Multiskan; Thermo, USA N/A
GAPDH  Primary antibodies  Affinity, USA AF7021 Rat
Glycated serum protein (GSP) Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering N/A
Transmission electron microscope Hitachi, Japan H-7650
Haematoxylin/eosin (HE) staining solution Servicebio, USA G1003
Image-Pro Plus MEDIA CYBERNETICS, USA N/A
Real-Time PCR Amplification Instrument Applied Biosystems, USA iQ5 
Irbesartan tablets Hangzhou Sanofi Pharmaceuticals N/A
Isopropanol Biosharp, Tianjin, China N/A
 JWSJS granules Guangdong Yifang Pharmaceutical N/A
Kodak Image Station 2000 MM imaging system Kodak, USA IS2000
Low-density cholesterol (LDL-C) Nanjing Jiancheng Institute of Biological Engineering N/A
MAPK3/1Primary antibodies  Affinity, USA AF0155 Rat
Medical Centrifuge Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development, China  TGL-16K
Mini trans-blot transfer system Bio-Rad, USA N/A
Mini-PROTEAN electrophoresis system Bio-Rad, USA N/A
NanoVue Plus Spectrophotometer Healthcare Bio-Sciences AB, Sweden 111765
p-EGFR Primary antibodies  Affinity, USA AF3044 Rat
Periodic acid-Schiff (PAS) staining solution Servicebio, USA G1008
p-MAPK3/1 Primary antibodies  Affinity, USA AF1015 Rat
Secondary antibodies  Santa Cruz, USA sc-2357 Rabbit
Streptozotocin Sigma, USA S0130
SureScript First-Strand cDNA Synthesis Kit GeneCopeia, USA QP056T
TriQuick Reagent Solarbio, Beijing, China R1100
Ultra-Clean Workbench Suzhou Purification Equipment, China SW-CJ-1F 
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Referencias

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Mao, J., Lu, Q., Gao, F., Liu, H., Tan, J. Antagonistic Effect of Jiawei Shengjiang San on a Rat Model of Diabetic Nephropathy: Related to EGFR/MAPK3/1 Signaling Pathway. J. Vis. Exp. (207), e66179, doi:10.3791/66179 (2024).
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