3D-Druck von Bakterien zur Untersuchung von Motilität und Wachstum in komplexen porösen 3D-Medien

Die Verwendung eines 3D-Biodruckers mit der körnigen Hydrogelmatrix erweitert die Möglichkeiten von Bioprintern, Bakterienkolonien in Formen zu drucken, die beim Drucken auf einem flachen Substrat aufgrund der niedrigen Viskosität der Bakteriensuspension zusammenbrechen würden. Die Auflösung des hier vorgestellten Ansatzes hängt von der Extrusionsgeschwindigkeit, der Größe der Nadel, der Geschwindigkeit des Druckkopfes, der Luft in der Nadel und der Viskosität der Bakteriensuspension ab. Aufgrund des geringen Volumens der Bakteriensuspension können beim Laden der Bakteriensuspension in Spritze und Nadel versehentlich Luftblasen eingebracht werden. Dies kann dazu führen, dass sich eine Luftblase in der endgültigen gedruckten Struktur ablagert (Abbildung 4). Eine andere Möglichkeit, Luftblasen in den Druck einzubringen, besteht darin, den Kolben nicht zu drücken, um vor dem Drucken einen kleinen Tropfen bakterieller Suspension an der Nadelspitze zu bilden, und an der Nadelspitze ein Luftspalt vorhanden ist. Wenn Sie den Spritzenkolben vor dem Drucken nicht drücken, kann dies auch dazu führen, dass unterschiedliche Zellvolumina in derselben Charge gedruckt werden. Im Laufe der Zeit löst sich die Luftblase jedoch im umgebenden Medium auf, wie in Abbildung 4 dargestellt. Für die Kalibrierung des Extrusionsschritts hängt das abgeschiedene Volumen davon ab, wie der Linearantrieb des Druckkopfes den Spritzenkolben übersetzt, der Innendurchmesser der Spritze wirkt sich direkt auf das Volumen aus. Darüber hinaus beeinflussen die rheologischen Eigenschaften der Bakteriensuspension, wie leicht sie durch die Nadelkontraktion scheren, um reibungslos zu drucken. Daher sollte dieses Kalibrierungsverfahren für jedes Spritzen-/Nadel-/Bakteriensuspensions-Setup wiederholt werden. Prinzipiell könnte die Spritzenkalibrierung automatisiert werden. In der Praxis wäre es jedoch eine Herausforderung, einen solchen Code zu schreiben, der für viele Anwendungsfälle gilt. Beispielsweise müsste ein Benutzer, der die Extrusion von ca. 300 μl aus einer 1-ml-Spritze kalibrieren möchte, die Spritze viel häufiger nachfüllen als ein Benutzer, der um ein Zielvolumen von 30 μl kalibriert. Da die Konstante für die E-Step-zu-Volumen-Kalibrierung zu Beginn des Kalibrierungsprozesses unbekannt ist, kann der Benutzer möglicherweise nicht genau vorhersagen, wie oft ein erneutes Laden tatsächlich erforderlich ist. Um den Kalibrierungsprozess zu automatisieren, müssten außerdem die genauen Positionen jedes vorgewogenen 1,5-ml-Röhrchens angegeben werden. Um sicherzustellen, dass die gesamte Biotinte von der Nadel für eine genaue Kalibrierung in das Röhrchen abgeschieden wird, muss ein präziser Kontakt zwischen der Nadel und dem Röhrchenboden/der Röhrchenwand hergestellt werden. Ohne guten Kontakt können kleine Tröpfchen benetzt und an der Nadel haften bleiben. Daher kann jede Positionsänderung zwischen den Röhrchen erheblich zu Fehlern im Kalibrierungsprozess beitragen. Aus diesen Gründen empfehlen die Autoren, dass jeder Benutzer ein Kalibrierungsprogramm erstellt, das seinen individuellen Anforderungen entspricht. Ein wesentliches Merkmal des hier vorgestellten Ansatzes ist die Möglichkeit, die Ausbreitung von Bakterien in ihrer Umgebung direkt über Motilität und Wachstum mittels Bildgebung zu visualisieren. In einer früheren Version des Protokolls für die Bildgebung wurden 6-Well-Platten mit 19 ml einer körnigen Hydrogelmatrix gefüllt. Aber selbst bei einem erfolgreichen 3D-Druck einer horizontalen Zelllinie, die auf einem inversen Mikroskop beobachtet werden könnte, würde auch auf der Oberseite des Mediums eine dichte Kolonie wachsen, was die Visualisierung mit der Hellfeldmikroskopie einschränkt (Abbildung 5). Die Kolonie auf der Oberseite resultierte wahrscheinlich aus einer Kontamination, als die Spritzennadel während des Drucks in das Medium eingeführt oder daraus entfernt wurde. Um dieses Problem zu umgehen, werden vertikale Zelllinien in Szintillationsfläschchen gedruckt (Abbildung 6A). Die Krümmung der zylindrischen Fläschchen führte jedoch zu Verzerrungen während der Bildgebung. Dies führte zur Auswahl von flachwandigen Küvetten und Gewebekulturflaschen als Probenbehälter für den Druck, die eine unverzerrte Bildgebung ermöglichten (Abbildung 6B-D). Eine Einschränkung von Gewebekulturflaschen ist der kleine geneigte Hals, der die Geometrien, die gedruckt werden können, begrenzt. Zusammengenommen ermöglicht dieses Protokoll die Beobachtung der bakteriellen Motilität und des Wachstums in komplexen porösen Umgebungen über lange Zeiträume. Einige Beispiele sind in Abbildung 6B-G für Biofilm-bildende V. cholerae mittels Hellfeldmikroskopie sowie für Planktonzellen von E. coli mittels Laser-Scanning-Fluoreszenz-Konfokalmikroskopie dargestellt – was die Vielseitigkeit dieses Ansatzes demonstriert. In der Tat ist ein potenzielles Problem von Hydrogelmatrizen ihre mögliche Autofluoreszenz bei der Abbildung mit Fluoreszenzmikroskopie; die in Abbildung 6F,G gezeigten Bilder zeigen jedoch, dass eine solche Autofluoreszenz in der hier vorgestellten experimentellen Plattform minimal ist. Eine weitere Einschränkung solcher optischer Mikroskopieansätze ist ihre räumliche Auflösung, die durch die Beugungsgrenze bei ~100 s Nanometern festgelegt wird; diese Längenskala ist jedoch viel kleiner als die Größe einer einzelnen Bakterienzelle, und daher bieten optische Techniken die Möglichkeit, Bakterienzellen von der Skala einzelner Zellen (Abbildung 6G) bis zur Skala größerer, mehrzelliger Kolonienabzubilden 30,31,32,33. Weitere Beispiele werden im Folgenden beschrieben. Wie oben erwähnt, kann der hier vorgestellte Ansatz verwendet werden, um Bakterienkolonien in kleinen (1 ml) und großen (20 ml) Matrixvolumina in 3D zu drucken und abzubilden. Daher werden die Unterschiede in den Ergebnissen, die mit verschiedenen Volumina erzielt wurden, im Folgenden anhand von 3D-gedruckten Kolonien von beweglichen und nicht-beweglichen V. cholerae als repräsentative Beispiele beschrieben. Die räumliche Auflösung (Breite der Linie) des Drucks wird durch den Innendurchmesser der Düse bestimmt. In den unten beschriebenen Beispielen ergibt eine Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,6 mm eine anfängliche zylindrische Kolonie von 0,6 mm. Frühere Arbeiten haben gezeigt, dass die Druckauflösung durch die Verwendung einer gezogenen Glaskapillare mit einem Innendurchmesser von ~100-200 μm33 noch weiter reduziert werden kann. Für die kleinen Volumina werden zwei verschiedene körnige Hydrogelmatrizen mit zwei unterschiedlichen Porengrößenverteilungen verwendet: eine mit einer mittleren Porengröße, die größer ist als der durchschnittliche Durchmesser einer V. cholerae-Zelle , 0,2-0,4μm 36, und die andere mit einer mittleren Porengröße, die kleiner als dieser Durchmesser ist. Die Proben über zwölf Tage werden abgebildet und durch Bildanalyse der räumlichen Ausdehnung der Kolonien im Laufe der Zeit gemessen (Abbildung 7 und Abbildung 8). Bei unbeweglichen Zellen, die sich nur durch Zellwachstum in ihrer Umgebung ausbreiten können, war die Geschwindigkeit der Flächenausdehnung zwischen den verschiedenen untersuchten Matrizen ähnlich (Abbildung 7), was darauf hindeutet, dass Unterschiede in der Matrixporengröße die zelluläre Ausbreitung durch Wachstum nicht beeinflussen – wie erwartet. Im Gegensatz dazu war für die beweglichen Zellen, die sich durch aktive Motilität in ihrer Umgebung ausbreiten, die Rate der räumlichen Ausdehnung von V. cholerae für die Hydrogelmatrix mit den größeren Poren höher – für die der Einschluss durch die Hydrogelkörner die Zellmotilität weniger behindert. Diese Unterschiede in der Bakterienausbreitung zeigten sich auch in den Koloniemorphologien (Abbildung 8). Die Kolonie von V. cholerae in Hydrogelmatrizen mit größeren Poren breitete sich durch glatte, diffuse Wolken aus (Abbildung 8A), was die Ausbreitung durch aktive Motilität widerspiegelt, wie zuvor beobachtet32. In Übereinstimmung mit dieser Interpretation werden diese diffusen Wolken bei nicht-beweglichen Zellen nicht beobachtet (Abbildung 8C). Außerdem sind die Poren so groß, dass die Zellen die Kügelchen nicht drücken, wenn sie durch die Poren schwimmen. Darüber hinaus beträgt die viskose Spannung, die beim Schwimmen ausgeübt wird, weniger als 1 Pa, was nicht ausreicht, um die umgebende Hydrogelmatrix nennenswert zu verformen. Im Gegensatz dazu breitet sich die Kolonie in Hydrogelmatrizen mit kleineren Poren nur durch raue, fraktalartige Wolken sowohl für bewegliche als auch für nicht-bewegliche Zellen aus (Abbildung 8B, D), was die Ausbreitung ausschließlich durch Zellwachstum widerspiegelt, während die Zellen wachsen, sie sich vorübergehend verformen und die umgebende Matrix abgeben. Da die Fließspannung der Hydrogelmatrizen viel kleiner ist als der Turgordruck der Zellen, bietet die Matrix in dieser Grenze der kleinen Porengröße nur einen schwachen Widerstand gegen Zellwachstum und scheint die 3D-gedruckte Struktur nicht stark zu beeinflussen, wie auch in unserer früheren Arbeit37 nachgewiesen wurde. Ähnliche Ergebnisse werden für Experimente beobachtet, die in großvolumigen Proben durchgeführt wurden; Angesichts der größeren Fülle an Nährstoffen in diesen Proben könnten die Experimente das Zellwachstum jedoch über längere Zeiträume aufrechterhalten. Als Beispiel werden Ergebnisse mit den granulären Hydrogelmatrizen gezeigt, bei denen die durchschnittliche Porengröße kleiner war als die Zellgröße – und somit die zelluläre Ausbreitung hauptsächlich auf das Wachstum zurückzuführen war. Die Proben werden ~30 Tage lang in den körnigen Hydrogelmatrizen abgebildet und beobachteten in den ersten 150 Stunden eine ähnliche Flächenausdehnung sowohl für nicht-bewegliche als auch für bewegliche Zellen; bei noch längeren Zeiten wird jedoch eine starke Variabilität zwischen den Proben beobachtet, wobei einige Proben schnellere Ausbreitungsraten aufweisen (Abbildung 9 und Abbildung 10). Interessanterweise wird bei der erneuten Beprobung der Hydrogelmatrix nach dem Experiment – ein Vorteil des großen Volumens der Hydrogelmatrix – eine Abnahme der Fließspannung, der Speichermodule und der Verlustmodule gemessen (Abbildung 11), was darauf hindeutet, dass die Matrizen weicher wurden. Diese Veränderung könnte darauf zurückzuführen sein, dass die V. cholerae ein Molekül produzieren, das die Eigenschaften der Hydrogelmatrix verändert und die zelluläre Ausbreitung über lange Zeiträume fördert, was in zukünftigen Forschungen interessant sein wird. Beispiele für die groben, fraktalartigen Koloniemorphologien, die zu diesen Experimenten führen, sind in Abbildung 10 dargestellt. Abbildung 1: Bilder des speziell angefertigten 3D-Bioprinters. (A) Biodrucker mit modifiziertem Spritzenpumpenextruderkopf mit Einweg-Luer-Lock-Spritze und -Nadel. Der Bioprinter ist ~46 cm breit. (B) Bild des 3D-Drucks von Zellen in Kolben, die mit gestauter Hydrogelmatrix gefüllt sind. Die Breite des Bildes beträgt 87 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: Charakterisierung der rheologischen Eigenschaften der granulären Hydrogelmatrizen. (A) Scherspannung in Abhängigkeit von der angelegten Schergeschwindigkeit. (B) Speicher- und Verlustmodul, G’ bzw. G”, in Abhängigkeit von der Schwingungsfrequenz. Die Legende gibt den Hydrogel-Massenanteil an, der zur Herstellung jeder Hydrogelmatrix verwendet wird. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: Porengrößenmessungen von zwei repräsentativen granularen Hydrogelmatrizen. Durch Tracking-Tracer wird die Verteilung der charakteristischen Porendimensionen für jede Hydrogelmatrix bestimmt. Die Daten werden durch 1-CDF dargestellt, wobei CDF die kumulative Verteilungsfunktion ist. Die Legende gibt den Hydrogel-Massenanteil an, der zur Herstellung jeder Matrix verwendet wurde. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Beispiele für Blasen, die beim 3D-Druck von Bakterien gebildet wurden. (A) Schematische Darstellung des Bildgebungsaufbaus. (B) Schnappschüsse des Wachstums von V. cholerae mit einer Blase am unteren Rand des Abdrucks (roter Kasten) in 1,2% Hydrogelmatrix, die in LB geschwollen ist. Nach 59 Stunden Wachstum bei 37 °C ist die Luftblase vollständig aufgelöst und das Volk kollabiert aufgrund der Elastizität der Hydrogelmatrix zurück. Maßstabsleiste = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Bilder der horizontalen Linie von beweglichen V. cholerae, gedruckt in einer Sechs-Well-Platte, die mit einer 1,2%igen Hydrogelmatrix gefüllt war, die in LB aufgequollen war, und dem Biofilm, der sich nach 48 Stunden Inkubation bei 37 °C auf der Oberseite bildete. (A) Schematische Darstellung des Bildgebungsaufbaus. (B) Die Biofilmbildung auf der Oberseite aufgrund von Verunreinigungen während des 3D-Drucks verringert die Opazität und ermöglicht keine klare Abbildung der horizontalen Linie. Die Oberseite bildet Falten, vermutlich aufgrund von unterschiedlichem Wachstum. Maßstabsleiste = 5 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Beispiele für verschiedene Probenbehälter, die in dieser Methode verwendet werden können. (A) V. cholerae gedruckt in einem Glasfläschchen, das mit einer 1,2%igen granulären Hydrogelmatrix gefüllt war, nach 470 h. Die Krümmung des Fläschchens erschwert die Darstellung des Wachstums. Maßstabsbalken = 5 mm. (B) V. cholerae gedruckt in einer Mikroküvette, die mit 1,2 % körniger Hydrogelmatrix gefüllt ist. Die flachen Seiten ermöglichen eine klare Bildgebung, die kleinen Volumina begrenzen jedoch die Dauer der Experimente, bevor den Zellen die Wachstumssubstrate ausgehen. (C) Bildgebungsaufbau mit einem Zoomobjektiv zum Bild von V. cholerae , gedruckt in einem Gewebekulturkolben, der mit 1,2 % körniger Hydrogelmatrix gefüllt ist. Ähnlich wie beim Mikroküvettengehäuse ermöglichen die flachen Seiten eine klare Bildgebung. Die Gewebekulturflaschen können mit größeren Volumina körniger Hydrogelmatrix gefüllt werden, wodurch die Versuchszeit verlängert wird. (D) Bild des Zoomobjektivs der V. cholerae , gedruckt in einer 1,2%igen körnigen Hydrogelmatrix nach 100 Stunden Inkubation bei 37 °C. Maßstabsbalken = 1 mm. (E) Bildgebungsaufbau mit einem konfokalen Mikroskop zur Abbildung fluoreszierender Zellen. (F) 3D-Projektion von konfokalen Mikroskopaufnahmen von fluoreszierenden E. coli in der 1,2%igen granulären Hydrogelmatrix nach 10-tägiger Inkubation bei 37 °C. Maßstabsbalken = 50 μm. (G) Konfokalmikroskopische Aufnahme von fluoreszierenden E. coli in der Hydrogelmatrix mit Einzelzellauflösung. Maßstabsbalken = 10 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Flächenausdehnung in Abhängigkeit von der Zeit von Kolonien von V. cholerae, gedruckt in 1 ml granulärer Hydrogel-Stützmatrizen. Die Daten auf dem Diagramm stammen aus der Bildanalyse von Abbildung 8. Es wurde beobachtet, dass sich bewegliche Zellen (geschlossener roter Kreis und Quadrat) schneller ausbreiten als die nicht-beweglichen Zellen, was die Ausbreitung sowohl durch Wachstum als auch durch Motilität widerspiegelt. Darüber hinaus breiten sich die beweglichen Zellen in der Hydrogelmatrix mit einer großen Porengröße (rote Quadrate) schneller aus als die Zellen in der Hydrogelmatrix mit 0,3 μm Poren (rote Kreise). Nicht-bewegliche Zellen zeigen keinen Unterschied in der Flächenexpansionsrate zwischen den beiden Porengrößen, da sie nur wachsen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 8: Kolonien von V. cholerae , gedruckt in 1 ml granulärer Hydrogel-Stützmatrizen. (A) Schnappschüsse des Wachstums und der Motilität von beweglichen V. cholerae in einer 0,9%igen granulären Hydrogelmatrix, bei der die Porengröße größer als der durchschnittliche Zelldurchmesser ist. Pfeile zeigen eine diffuse Wolke an, die sich bildet, wenn sich Zellen durch die Hydrogelmatrix bewegen. (B) Momentaufnahmen des Wachstums und der Motilität von beweglichen V. cholerae in einer 1,2%igen körnigen Hydrogelmatrix, bei der die Porengröße kleiner als der durchschnittliche Zelldurchmesser ist. Pfeile zeigen eine raue, fraktalartige Wolke an, die sich durch Zellwachstum bildet. (C) Momentaufnahmen der zeitlichen Entwicklung von nicht-beweglichen V. cholerae in 0,9% körniger Hydrogelmatrix, bei der die Porengröße größer als der durchschnittliche Zelldurchmesser ist. In diesem Fall sind diffuse Wolken, die die Motilität widerspiegeln, nicht beobachtbar. (D) Momentaufnahmen des Wachstums von unbeweglichen V. cholerae in einer 1,2%igen körnigen Hydrogel-Trägermatrix, bei der die Porengröße kleiner als der durchschnittliche Zelldurchmesser ist. In diesem Fall sind wieder raue, fraktalartige Wolken zu beobachten, die das Wachstum widerspiegeln. Maßstabsleisten = 1 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 9: Flächenausdehnung in Abhängigkeit von der Zeit von Kolonien von V. cholerae, gedruckt in 20 ml 1,2% körniger Hydrogel-Stützmatrizen. Es wird beobachtet, dass sich unbewegliche (offene Kreise) und bewegliche Zellen (geschlossene Kreise) in den ersten 100 Stunden mit ähnlichen Geschwindigkeiten ausbreiten. Nach 100 Stunden werden Unterschiede in den Expansionsraten der Fläche beobachtet, möglicherweise aufgrund der Entwicklung der Variabilität über lange Zeiträume. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 10: Kolonien von V. cholerae, gedruckt in 22 ml 1,2 % körniger Hydrogelmatrizen, die bei 37 °C gezüchtet wurden. (Oben) Momentaufnahmen des Wachstums von beweglichen V. cholerae. (Unten) Momentaufnahmen des Wachstums von nicht-beweglichen V. cholerae. In beiden Fällen sind raue, fraktalartige Wolken zu beobachten, die das Wachstum widerspiegeln. Maßstabsleisten = 2 mm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 11: Charakterisierung der rheologischen Eigenschaften der 1,2%igen granulären Hydrogelmatrix vor (0 h) und nach dem Experiment (397 h). (A) Scherspannung in Abhängigkeit von der angelegten Schergeschwindigkeit. (B) Speicher- und Verlustmodul, G’ bzw. G”, in Abhängigkeit von der angelegten Schwingungsfrequenz. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Gcode-Befehle Aufgaben M82 Absoluter Extrusionsmodus M302 S0 Kaltfließpressen ermöglichen M92 E14575 Legen Sie die Extrusionsschritte pro mm fest G92 X35.61 Y81 Z0 E0.0 Stellen Sie die z-Achsen- und Extrusionsposition auf Null und die x-,y-Position auf 35,71 mm und y 88 mm ein, wo sich der Druckkopf befindet, wenn der G-Code beginnt M221 S100 T0 setzt die Durchflussmenge auf 100% M107 Schalten Sie den Lüfter aus G1 F1 X35.61 Y81 E0.1 Extrudieren Sie die 20 μl Biotinte mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 50 μl/min in die Matrix, wo die aktuelle Position eingestellt wurde G0 F200 Z60 Nadel mit einer Geschwindigkeit von 200 mm/min aus der Matrix und dem Probenbehälter ziehen G0 F500 X65.81 Y81.0 Bewegen Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 500 mm/min zum nächsten Probenkontiiner G0 F100 Z0 Senken Sie die Nadel in den nächsten Probenbehälter auf die gleiche z-Position, an der der Druck mit einer Geschwindigkeit von 100 mm/min begonnen hat G1 F1 X65.81 Y81.0 E0.2 Extrudieren Sie die 20 μl Biotinte mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 50 μl/min in die Matrix, wo die aktuelle Position eingestellt wurde G0 F200 Z60 Nadel mit einer Geschwindigkeit von 200 mm/min aus der Matrix und dem Probenbehälter ziehen G0 F500 X96.01 Y81.0 Bewegen Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 500 mm/min zum nächsten Probenkontiiner G0 F100 Z0 Senken Sie die Nadel in den Probenbehälter auf die gleiche z-Position, an der der Druck mit einer Geschwindigkeit von 100 mm/min begonnen hat G1 F1 X96.01 Y81.0 E0.3 Extrudieren Sie die 20 μl Biotinte mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 50 μl/min in die Matrix, wo die aktuelle Position eingestellt wurde G0 F200 Z60 Nadel mit einer Geschwindigkeit von 200 mm/min aus der Matrix und dem Probenbehälter ziehen G0 F500 X126.21 Y81.0 Bewegen Sie die Nadel mit einer Geschwindigkeit von 500 mm/min zum nächsten Probenkontiiner G0 F100 Z0 Senken Sie die Nadel in den nächsten Probenbehälter auf die gleiche z-Position, an der der Druck mit einer Geschwindigkeit von 100 mm/min begonnen hat G1 F1 X126.21 Y81.0 E0.4 Extrudieren Sie die 20 μl Biotinte mit einer Vorschubgeschwindigkeit von 50 μl/min in die Matrix, wo die aktuelle Position eingestellt wurde G0 F200 Z80 Nadel mit einer Geschwindigkeit von 200 mm/min aus der Matrix und dem Probenbehälter ziehen Tabelle 1: G-Code-Programmierung zum Drucken vertikaler Linien der Bakteriensuspension. Ergänzende Datei 1: STL-Datei für die untere Klemme 1 ml Einweg-Luer-Lock-Spritzen für den Spritzenextruder. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 2: STL-Datei für die obere Klemme für 1-ml-Einweg-Luer-Lock-Spritzen für den Spritzenextruder. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 3: STL-Datei für den Spritzenadapter für 1-ml-Einweg-Luer-Lock-Spritzen für den Spritzenextruder. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 4: STL-Datei für den Küvetten-Probenhalter. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 5: STL-Datei für den Probenhalter für Gewebekolben. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 6: STL-Datei für die 6-Well-Platte und das 35-mm-Petrischalen-Druckbett. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Datei 7: Benutzerdefiniertes Skript für die Partikelverfolgung. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.