Zebra Balığı Titreşim İrkilme Tepkisi Tarama Sistemi Kullanılarak Kimyasalların Toksisitesinin Değerlendirilmesi
Summary
Zebra balığı embriyo titreşimi ürkütücü tepkisine dayalı olarak kimyasal bileşik toksisitesini değerlendirmek için bir tarama sisteminin iş akışını ve veri analizini açıklıyoruz. Sistem, zebra balığı embriyolarının bir titreşim uyaranına maruz kaldıklarında hareketlerini kaydeder ve genel toksisite/ölümcüllük ve nöromüsküler toksisitenin entegre bir değerlendirmesine izin verir.
Abstract
Zebra balığı embriyolarında nöromüsküler ve genel toksisitenin değerlendirilmesi için basit bir tarama sistemi geliştirdik. Modüler sistem, üzerine embriyolu doku kültürü kaplarının yerleştirilebildiği elektrodinamik transdüserlerden oluşur. Bu tür birden fazla hoparlör-doku kültürü kabı çifti birleştirilebilir. Elektrodinamik transdüserler tarafından üretilen titreşimsel uyaranlar, embriyolarda karakteristik bir irkilme ve kaçış tepkisine neden olur. Kayış tahrikli doğrusal bir tahrik, embriyoların hareketini kaydetmek için her hoparlörün üzerine sırayla bir kamera yerleştirir. Bu şekilde, kimyasal bileşiklerin ölümcüllüğü veya nöromüsküler toksisitesi nedeniyle irkilme tepkisindeki değişiklikler görselleştirilebilir ve ölçülebilir. Embriyoların ve tedavi solüsyonlarının hazırlanması, kayıt sisteminin çalıştırılması ve tahlilde aktif olan bileşiklerin kıyaslama konsantrasyon değerlerini hesaplamak için veri analizi dahil olmak üzere bu sistemi kullanarak kimyasal bileşik taraması için iş akışının bir örneğini sunuyoruz. Piyasada bulunan basit bileşenlere dayalı modüler montaj, bu sistemi hem ekonomik hem de belirli laboratuvar kurulumlarının ve tarama amaçlarının ihtiyaçlarına esnek bir şekilde uyarlanabilir hale getirir.
Introduction
Son yıllarda, zebra balıkları, ilaç geliştirmeden çevresel toksikolojiye kadar araştırma alanlarını kapsayan, kimyasal bileşik etkilerinin değerlendirilmesi için oldukça popüler model organizmalar haline gelmiştir1. Omurgalılar olarak zebra balıkları, genetik yapılarının ve genel fizyolojilerinin birçok yönünü insanlarla paylaşır 2,3. Bu nedenle, bu modelde elde edilen sonuçlar genellikle insan sağlığı ile doğrudan ilgilidir. Şu anda klinik çalışmalarda olan birkaç ilaç adayı, zebra balığı4 kullanılarak bileşik ekranlarda tanımlanmıştır.
Toksisite değerlendirmesi, zebra balığı embriyonik aşamalarını kullanan testlerin ilgi çekici olduğu önemli bir uygulamadır. Çevresel toksisite testinde zebra balığının kullanımı için çeşitli Ekonomik İşbirliği ve Kalkınma Örgütü (OECD) test kılavuzları mevcuttur 5,6. Zebra balığı embriyolarının küçük boyutu ve hızlı gelişimi, onları orta ila yüksek verim ölçeğinde tarama yaklaşımları için son derece uygun hale getirir 1,3,4. Bu tür taramalar tarafından hedeflenen toksikolojik uç noktalar arasında embriyonik malformasyonlar ve ölümcüllük7, endokrin bozulma8, organ toksisitesi9 ve nöral toksisiteyi gösteren davranışsal değerlendirmeler10,11 bulunur. Davranışsal tahliller mümkündür çünkü zebra balığı embriyoları, gelişim aşamalarına bağlı olarak farklı uyaranlara çeşitli lokomotor tepkiler gösterir. Örneğin, döllenmeden 1 gün sonra (dpf) embriyolar spontan kuyruk kıvrılmasını12 gösterir ve fotomotor yanıtı (PMR) 10 olarak adlandırılan tipik bir hareket dizisi ile bir dizi ışık darbesine yanıt verir. Yumurtadan çıktıktan sonra, tipik olarak döllenmeden (hpf) yaklaşık 48-72 saat sonra meydana gelen, serbestçe yüzen eleutheroembriyolar13, 4 dpf14 civarında başlayan titreşim uyaranlarına yavaş yavaş irkilme ve kaçış tepkileri geliştirir. Bu tepkiler, uyaranın yönünün tersine yöne doğru belirgin bir bükülme (C-bend veya C-start olarak adlandırılır) ile karakterize edilir, bunu daha küçük bir karşı viraj ve yüzme davranışı 14,15,16,17 takip eder. Özellikle, embriyonik davranışlar, çeşitli nörotransmitter sistemleri kullanan nöral devreler tarafından yönetilir ve bu sistemleri hedef alan kimyasal bileşik etkilerinin araştırılmasına izin verir. Örneğin, PMR testi, kolinerjik, adrenerjik ve dopaminerjik sinyallemeye10 müdahale eden bileşiklerin etkilerini ortaya çıkarırken, irkilme tepkisi kolinerjik, glutamaterjik ve glisinerjik nöronlarıiçerir 16,18. Ayrıca, kaslara veya nöro-müsküler arayüze zarar veren bileşikler, iç kulak/lateral çizgi kıl hücreleri için toksik bileşikler gibi bu davranışları da etkileyecektir19,20. Bu nedenle, bir uyarana yanıt olarak zebra balığı lokomotor davranışını gözlemlemek, yalnızca nörotoksisiteyi değil, aynı zamanda ototoksisite ve miyotoksisiteyi değerlendirmek için uygun bir araçtır. Lokomotor davranışın puanlanması, ölü embriyolar hareket etmediği için genel toksisite / ölümcüllük değerlendirmesi için bir vekil görevi görür. Bu nedenle, embriyonik hareket davranışları, tek bir kurulumda ölümcül ve nöromüsküler bileşik etkilerini gösteren birinci kademe toksisite tarama yaklaşımı için bütünleştirici bir okumayı temsil eder. Eleutheroembriyoların zaten bileşikleri metabolize edebildiği göz önüne alındığında, yaklaşım aynı zamanda metabolik dönüşüm ürünlerininetkilerini de tespit edebilir 7,21,22. Daha da önemlisi, zebra balığı embriyoları, 120 hpf13’ten sonra serbest beslenme aşamasına kadar bazı hayvan koruma mevzuatları kapsamında korunan yaşam evresi olarak kabul edilmemektedir. Bu nedenle, hayvan toksisite testine bir alternatif olarak kabul edilirler.
Şekil 1: Titreşim irkilme tepki sistemi kurulumu. (A) Sisteme genel bakış. Test bileşiklerine maruz kalan embriyolara sahip plakalar, elektrodinamik dönüştürücü dizisine (“hoparlörler”) yerleştirilir. Kamera, kayış tahrikli lineer tahrik tarafından sırayla hedeflenen dönüştürücünün üzerindeki kayıt konumuna hareket ettirilir. (B) Ayrıntılı view üstüne doku kültürü kabı yerleştirilmiş dönüştürücünün/hoparlörün. Plakalar aşağıdan 4000-5000 lükste bir LED ışık levhası ile aydınlatılır. Uyaran verilirken hoparlörün yanındaki bir LED ışığı yanar. (C) Embriyoların uyarılması üzerine kamera tarafından kaydedilen videonun hareketsiz görüntüsü. (D) Yapılandırma dosyasının ekran görüntüsü. (E) Kayıt yazılımı arayüzünün ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Burada, bir doku kültürü kabında serbestçe hareket eden birkaç embriyonun otomatik bir video kaydı ile birleştirilmiş elektrodinamik transdüserler tarafından üretilen titreşim uyaranlarına dayalı bir kurum içi yapı basit test cihazı kullanarak titreşim irkilme tepkisi üzerindeki bileşik etkilerin değerlendirilmesi için bir test protokolünü açıklıyoruz23. Sistem modülerdir ve paralel olarak birkaç doku kültürü kabından sıralı kayıt yapılmasına izin verir. Şu anda kullanılan düzenekte, beş elektrodinamik transdüser, üzerlerine yerleştirilmiş 20 embriyo içeren doku kültürü kaplarına titreşimsel bir uyaran (500 Hz, süre 1 ms) sağlar (Şekil 1). Plakalar LED ışık levhaları ile 4000-5000 lux’te alttan aydınlatılır. Her dönüştürücünün yanındaki bir LED ışık, uyaranın uygulama dönemlerini gösterir ve bir osiloskop, uygulanan uyaranın dalga biçimlerini ve frekansını gösterir (ayrıntılar için bkz . Ref. 23). Embriyoların davranışı, saniyede 1000 kare (fps) hızında yüksek hızlı bir kamera (Malzeme Tablosu) tarafından kaydedilir ve bu, kayış tahrikli doğrusal bir sürücü tarafından hedeflenen hoparlörün üzerine taşınır. Bu kayıt hızı, irkilme tepkisini güvenilir bir şekilde çözmek için gereklidir. Sistem, mevcut ticari sistemlere düşük maliyetli, bireysel olarak uyarlanabilir bir alternatif sunar. Aşağıda ayrıntıları verilen kesin iş akışı, seçilen bir dizi toksik madde ile muamele edilen zebra balığı embriyolarından OMICS veri toplama için uygun maruz kalma koşullarını belirlemek amacıyla şu anda Hassas Toksikoloji girişimi24 çerçevesinde gerçekleştirilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Özel yapım bir zebra balığı embriyo titreşim ürkütücü test kurulumu kullanarak kimyasal bileşik değerlendirmesi için iş akışını ve veri analizini sunuyoruz. İş akışı, kıyaslama konsantrasyonu/dozu (BMC/BMD) gibi bileşik toksisitesini belirten tipik parametrelerin hesaplanmasına olanak tanıyan sağlam veriler üretir. Kurulumun modülerliği, verim ve alan gereksinimleri için farklı ihtiyaçlara uyum sağlar. Sistem, nispeten basit bir kurulumun ardından düşük maliyetli bazal bileşenlerden yapıldığından, genellikle aynı anda birkaç tahlil türü için tasarlanan, tescilli yazılıma dayanan ve nispeten maliyetli olan mevcut ticari sistemlere ucuz bir alternatif sunar.
Hem bu ticari sistemler hem de diğer ısmarlama sistemler, çok kuyulu plakalarda tek embriyoların veya larvaların değerlendirilmesine izin verir (örneğin, 12 kuyulu34, 16 oyuklu32,35, 24-kuyulu 20,33,36, 48-kuyucuklu37, 96-kuyucuklu 38,39,40,41,42 ve hatta 384-kuyulu [4×96 kuyu olarak]43), ancak kuyulardaki uzamsal kısıtlama, kaçış tepkisinin bazı veri parametrelerinin (örneğin, kat edilen mesafe) analizini daha zor hale getirir. Ayrıca, bu kurulumların bazılarında görüntüleme, plakanın kuyularının bir alt kümesiyle sınırlıdır ve bu da verimi36,39 azaltır. Embriyoların bulaşıklarda görüntülenmesi, kaçış yanıtı parametrelerinin daha iyi değerlendirilmesine olanak tanır ve aynı anda birkaç embriyonun davranışının kaydedilmesini sağlar (örneğin 6 cm’lik bir tabakta 30’a kadar). Genellikle, çanak tabanlı görüntüleme, çalışma başına bir tabak ile sınırlıdır 44,45,46,47,48 (istisnalar, her biri bir larva içeren 6 tabakta49 veya 2 bölünmüş tabakta 4 larvaüzerinde paralel görüntüleme gerçekleştirir 50), bizim durumumuzda olduğu gibi paralel tasarımlarla çözülebilecek bir dezavantaj. Bu çalışmada kullanılan sistemin bazı özelliklerini ve diğer ticari ve ısmarlama çözümleri Tablo 2’de özetledik 20,32,33,34,35,36,37,38,39,40,41,42,43, 44,45,46,47,48,49,50,
51,52.
Yöntemin bir avantajı, toksisite değerlendirmelerinin performansını artırabilen hem ölümcüllüğü hem de davranış değişikliklerini yakalayan bir okumadır. Örneğin, zebra balığı embriyosu akut toksisite testinin (FET)5 yetişkin balık akut toksisite testinde53 toksisiteyi oldukça iyi tahmin ettiği gösterilmiş olsa da, davranışsal okumalar54 dahil edilerek tahmin doğruluğu iyileştirilmiştir. Bunun nedeni, muhtemelen yavru veya yetişkin balıklarda artan toksisiteye neden olan solunum yetmezliği sendromunun olmaması nedeniyle, balık embriyolarında görülen nöroaktif bileşiklerin neden olduğu zayıf ölüm oranıdır. Bununla birlikte, nöroaktivite, davranışın değerlendirilmesi ile tanımlanabilir. Ayrıca, davranışsal okumalar, miyotoksik ve ototoksik etkilerin yanı sıra, fizyoloji üzerinde, öldürücü olmayan ancak organizmanın davranışsal performansını etkileyen diğer, daha ince toksik etkileri de yakalayabilir.
Testi gerçekleştirirken, homojen olarak gelişen bir zebra balığı embriyosu partisinin kullanılmasının yanı sıra bileşiklerin uygun şekilde işlenmesini sağlamak çok önemlidir. Bu nedenle, bileşik depolama için cam şişelerin kullanılması, plastik malzemeye absorbans nedeniyle kimyasalların, özellikle hidrofobik bileşiklerin konsantrasyonlarındaki düşüşü en aza indirmelidir. “Plastik” polistirene yüksek emme potansiyeline sahip bileşikler söz konusu olduğunda, inkübasyon için cam plakalar da kullanılabilir. Ölü embriyoların toplanması ve uzaklaştırılması için kullanılan doku kültürü kaplarındaki yumurtaların temizlenmesi standart gelişimin sağlanması için kritik bir adımdır. Gelişimsel gecikmeler, değerlendirilen davranışın altında yatan sinir ağlarının olgunluğunu etkileyebileceğinden, normal gelişim hızı önemlidir14,33. Ayrıca, bileşik etkilerin karşılaştırılmasını sağlamak için, farklı suşların farklı davranış profilleri sunduğu bildirildiğinden, yumurtalar aynı suştan türetilmelidir 38,55,56,57. Maruz kalma sırasında, test edilen konsantrasyonları değiştirecek olan E3 ortamının aşırı buharlaşmasını önlemek için embriyoların nemlendirilmiş bir odada inkübe edilmesi önemlidir.
Test serisinde kullanılan belirli embriyo grubunun temel yanıt seviyesini belirlemek için her çalışmaya E3 kontrolleri dahil edilmelidir. Tipik olarak, her 5 ölçüm seti boyunca bir kontrol plakası çalıştırırız. Şekil 2D’de gösterildiği gibi, bu yaklaşım aynı zamanda gecikmiş gelişim veya genetik arka plan etkileri gibi diğer nedenlerden dolayı optimal olmayan yanıtlara sahip partilerin tespit edilmesine de izin verir. Uyarana beklenmedik bir yanıt eksikliği durumunda, olası dönüştürücü arızasına da dikkat edin. Tipik olarak, irkilme tepkileri, bir log-lojistik model kullanılarak eğri uydurmaya izin veren sigmoidal bir konsantrasyon-tepki davranışı gösterir. Bununla birlikte, bifazik yanıtları olan nadir durumlarda, Gauss veya Cedergreen modelleri gibi başka modellerin kullanılması gerekebilir. R paketleri drc ve bdm27,28 içinde mevcutturlar.
Titreşimsel uyarana yanıt eksikliği, genel sitotoksisite nedeniyle embriyoların ölümünü veya ciddi şekilde bozulmuş yaşam fonksiyonlarını gösterebilir, ancak aynı zamanda uyaran algısı, entegrasyon ve lokomotor çıktının nöral devrelerini hedef alan daha spesifik toksisiteyi de yansıtabilir. Diğer olası bileşik etkiler, nöromüsküler arayüze veya kas yapısı ve işlevine müdahaledir. Bu olasılıkları ayırt etmek için daha fazla tahlil gereklidir. Örneğin, kasların yapısal bütünlüğü bir çift kırılmalılık testi 58,59 ile değerlendirilebilir ve kas ve nöral fonksiyonun uygunluğunu değerlendirmek için transgenik çizgilermevcuttur 60,61. Bununla birlikte, kaydedilen video verileri, ilk ek bilgiyi sağlayabilecek embriyoların morfolojisinin ve davranışsal tepkisinin daha ayrıntılı bir analizine zaten izin vermektedir. Sadece C-bendi mi yoksa tüm motilite mi bozuldu? Zayıf veya titreyen kuyruk hareketleriyle gösterildiği gibi hala nöromüsküler aktivite kalıntıları var mı? Bu tür değişmiş davranışlar, ödem veya artmış vücut eğriliği gibi morfolojideki değişikliklerle birlikte mi gidiyor? Ek olarak, C-virajına kadar gecikme süresi veya kaçış tepkisi sırasında kat edilen mesafe gibi parametreler değerlendirilebilir (bkz.ample, Ref. 44).
Burada açıklanan tarama protokolü, öldürücü olmayan nörotoksik, ototoksik ve miyotoksik bileşikleri spesifik olarak tespit etme katma değeri ile hızlı ve sağlam bileşik toksisite değerlendirmelerine izin verir. Sağlanan analiz iş akışının uygulanması kolaydır ve sağlam bir okuma sağlar. Titreşim irkilme tahlilinde kullanılan uyaran protokollerinin modifikasyonları, darbe öncesi inhibisyon (PPI)39,44 ve alışkanlık32,33 gibi irkilme davranışının daha karmaşık yönleri üzerindeki bileşik etkileri ele almak için kullanılmıştır ve bu çalışmada kullanılan elektrodinamik dönüştürücü tabanlı uyaran kurulumuna uyarlanabilir.
İrkilme tepkisine dayalı tarama sistemlerinin ana uygulaması, hem insan toksisite değerlendirmesi hem de ilaç geliştirmeile ilgili olan kimyasal ekranlardaki bileşik etkilerin değerlendirilmesidir 1,4,62. Aynı zamanda, suda yaşayan bir organizmanın erken yaşam evrelerini test ederek, elde edilen sonuçlar ekotoksikolojik risk değerlendirmesi ile doğrudan ilgilidir63,64. Ek olarak, irkilme tepki sistemleri genetik taramalardadavranışsal fenotipleme için kullanılabilir 65,66,67,68,69. Kolayca uygulanabilir ve uyarlanabilir sistemimiz, bu çeşitli uygulama alanlarında kendi özel tarama projelerini yürütmek isteyen daha küçük laboratuvarlara uygun maliyetli bir kurulum sağlar.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IBCS-BIP balık tesisi ve tarama merkezindeki destek personelinin mükemmel teknik yardımına teşekkür ederiz. Bu çalışma, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programından 965406 No’lu Hibe Sözleşmesi (PrecisionTox) kapsamında fon almıştır. Bu çıktı yalnızca yazarların görüşünü yansıtmaktadır ve Avrupa Birliği, burada yer alan bilgilerin herhangi bir şekilde kullanılmasından sorumlu tutulamaz.
Materials
| Fine test sieves, Brass frame, pore size 250 μm | Sigma-Aldrich | Z289744-1EA | Or comparable material |
| High-speed camera | XIMEA | MQ013MG-ON USB 3 | |
| Laboratory Bottles, Narrow Neck, with Screw Cap | VWR | 215-3261 | Reference number for 50 mL, available up to 20 L. Or comparable material |
| Pipette tip, working volume: 10 µL | SARSTEDT | 70.3010.210 | Or comparable material |
| Pipette tip, working volume: 1000 µL | SARSTEDT | 70.3050.100 | Or comparable material |
| Pipette tip, working volume: 20 µL | SARSTEDT | 70.3020.210 | Or comparable material |
| Pipette tip, working volume: 200 µL | SARSTEDT | 70.3030.100 | Or comparable material |
| Serological pipette 10 mL | SARSTEDT | 86.1254.001 | Or comparable material |
| Serological pipette 25 mL | SARSTEDT | 86.1685.001 | Or comparable material |
| Serological pipette 5 mL | SARSTEDT | 86.1253.001 | Or comparable material |
| Tissue culture dish 60,0 mm/15,0 mm vented (Polystyrene) | Greiner bio-one | 628102 | Or comparable material |
| Tissue culture dish 100, suspension (Polystyrene) | SARSTEDT | 83.3902.500 | Or comparable material |
| Transfer pipette 6 mL | SARSTEDT | 86.1175 | Or comparable material |
| Tube 15 mL 120 mm x 17 mm PP | SARSTEDT | 62.554.502 | Or comparable material |
| Tube 50 mL 114mm x 28 mm PP | SARSTEDT | 62.5472.54 | Or comparable material |
Referencias
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Howe, K., et al. The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).
- Choi, T. Y., Choi, T. I., Lee, Y. R., Choe, S. K., Kim, C. H. Zebrafish as an animal model for biomedical research. Exp Mol Med. 53 (3), 310-317 (2021).
- Patton, E. E., Zon, L. I., Langenau, D. M. Zebrafish disease models in drug discovery: from preclinical modelling to clinical trials. Nat Rev Drug Discov. 20 (8), 611-628 (2021).
- OECD. Test No. 236: Fish embryo acute toxicity (FET) Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2013).
- OECD. Test No. 250: EASZY assay – Detection of endocrine active substances, acting through estrogen receptors, using transgenic tg(cyp19a1b:GFP) zebrafish embryos. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2021).
- Braunbeck, T., et al. The fish embryo test (FET): origin, applications, and future. Environ Sci Pollut Res Int. 22 (21), 16247-16261 (2015).
- Weger, B. D., Weger, M., Nusser, M., Brenner-Weiss, G., Dickmeis, T. A Chemical screening system for glucocorticoid stress hormone signaling in an intact vertebrate. ACS Chem Biol. 7 (7), 1178-1183 (2012).
- Pandey, G., Westhoff, J. H., Schaefer, F., Gehrig, J. A Smart imaging workflow for organ-specific screening in a cystic kidney zebrafish disease model. International Journal of Molecular Sciences. 20 (6), 1290 (2019).
- Kokel, D., et al. Rapid behavior-based identification of neuroactive small molecules in the zebrafish. Nat Chem Biol. 6 (3), 231-237 (2010).
- Zhang, K., Liang, J., Brun, N. R., Zhao, Y., Werdich, A. A. Rapid zebrafish behavioral profiling assay accelerates the identification of environmental neurodevelopmental toxicants. Environ Sci Technol. 55 (3), 1919-1929 (2021).
- Ogungbemi, A. O., Teixido, E., Massei, R., Scholz, S., Kuster, E. Optimization of the spontaneous tail coiling test for fast assessment of neurotoxic effects in the zebrafish embryo using an automated workflow in KNIME(R). Neurotoxicol Teratol. 81, 106918 (2020).
- Strahle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments–a commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reprod Toxicol. 33 (2), 128-132 (2012).
- Kimmel, C. B., Patterson, J., Kimmel, R. O. The development and behavioral characteristics of the startle response in the zebra fish. Dev Psychobiol. 7 (1), 47-60 (1974).
- Eaton, R. C., Bombardieri, R. A., Meyer, D. L. The mauthner-initiated startle response in teleost fish. Journal of Experimental Biology. 66 (1), 65-81 (1977).
- Berg, E. M., Bjornfors, E. R., Pallucchi, I., Picton, L. D., El Manira, A. Principles governing locomotion in vertebrates: Lessons from zebrafish. Front Neural Circuits. 12, 73 (2018).
- Lopez-Schier, H. Neuroplasticity in the acoustic startle reflex in larval zebrafish. Curr Opin Neurobiol. 54, 134-139 (2019).
- Hale, M. E., Katz, H. R., Peek, M. Y., Fremont, R. T. Neural circuits that drive startle behavior, with a focus on the Mauthner cells and spiral fiber neurons of fishes. J Neurogenet. 30 (2), 89-100 (2016).
- Behra, M., Etard, C., Cousin, X., Strahle, U. The use of zebrafish mutants to identify secondary target effects of acetylcholine esterase inhibitors. Toxicol Sci. 77 (2), 325-333 (2004).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W. S., Whitfield, T. T. Ototoxin-induced cellular damage in neuromasts disrupts lateral line function in larval zebrafish. Hear Res. 284 (1-2), 67-81 (2012).
- van Wijk, R. C., Krekels, E. H. J., Hankemeier, T., Spaink, H. P., vander Graaf, P. H. Systems pharmacology of hepatic metabolism in zebrafish larvae. Drug Discovery Today: Disease Models. 22, 27-34 (2016).
- Loerracher, A. K., Braunbeck, T. Cytochrome P450-dependent biotransformation capacities in embryonic, juvenile and adult stages of zebrafish (Danio rerio)-a state-of-the-art review. Arch Toxicol. 95 (7), 2299-2334 (2021).
- Marcato, D. . Design and Development of Imaging Platforms for Phenotypic Characterization of Early Zebrafish. , (2018).
- PrecisionTox Consortium. The precision toxicology initiative. Toxicol Lett. 383, 33-42 (2023).
- Nüsslein-Volhard, C. . Zebrafish – A Practical Approach. , (2002).
- Berthold, M. R., Preisach, C. h. r. i. s. t. i. n. e., Burkhardt, H. a. n. s., Schmidt-Thieme, L. a. r. s., Decker, R. e. i. n. h. o. l. d., et al. . Data Analysis, Machine Learning and Applications. , (2008).
- Ritz, C., Baty, F., Streibig, J. C., Gerhard, D. Dose-response analysis using R. PLoS ONE. 10 (12), e0146021 (2015).
- Jensen, S. M., Kluxen, F. M., Streibig, J. C., Cedergreen, N., Ritz, C. bmd: an R package for benchmark dose estimation. Peerj. 8, e10557 (2020).
- Committee, E. S., et al. Guidance on the use of the benchmark dose approach in risk assessment. EFSA J. 20 (10), e07584 (2022).
- Haber, L. T., et al. Benchmark dose (BMD) modeling: current practice, issues, and challenges. Crit Rev Toxicol. 48 (5), 387-415 (2018).
- Carter, K. M., Woodley, C. M., Brown, R. S. A review of tricaine methanesulfonate for anesthesia of fish. Reviews in Fish Biology and Fisheries. 21 (1), 51-59 (2011).
- Wolman, M. A., Jain, R. A., Liss, L., Granato, M. Chemical modulation of memory formation in larval zebrafish. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (37), 15468-15473 (2011).
- Roberts, A. C., et al. Habituation of the C-start response in larval zebrafish exhibits several distinct phases and sensitivity to NMDA receptor blockade. PLoS One. 6 (12), e29132 (2011).
- Marquez-Legorreta, E., et al. Brain-wide visual habituation networks in wild type and fmr1 zebrafish. Nat Commun. 13 (1), 895 (2022).
- Panlilio, J. M., Aluru, N., Hahn, M. E. Developmental neurotoxicity of the harmful algal bloom toxin domoic acid: Cellular and molecular mechanisms underlying altered behavior in the zebrafish model. Environ Health Perspect. 128 (11), 117002 (2020).
- Zeddies, D. G., Fay, R. R. Development of the acoustically evoked behavioral response in zebrafish to pure tones. J Exp Biol. 208 (Pt 7), 1363-1372 (2005).
- Levitz, J., et al. Optical control of metabotropic glutamate receptors. Nat Neurosci. 16 (4), 507-516 (2013).
- Best, J. D., et al. Non-associative learning in larval zebrafish. Neuropsychopharmacology. 33 (5), 1206-1215 (2008).
- Bhandiwad, A. A., Zeddies, D. G., Raible, D. W., Rubel, E. W., Sisneros, J. A. Auditory sensitivity of larval zebrafish (Danio rerio) measured using a behavioral prepulse inhibition assay. J Exp Biol. 216 (Pt 18), 3504-3513 (2013).
- Liu, F., et al. Solute carrier family 26 member a2 (slc26a2) regulates otic development and hair cell survival in zebrafish. PLoS One. 10 (9), e0136832 (2015).
- Singh, C., Oikonomou, G., Prober, D. A. Norepinephrine is required to promote wakefulness and for hypocretin-induced arousal in zebrafish. Elife. 4, e07000 (2015).
- Joo, W., Vivian, M. D., Graham, B. J., Soucy, E. R., Thyme, S. B. A customizable low-cost system for massively parallel zebrafish behavioral phenotyping. Front Behav Neurosci. 14, 606900 (2020).
- Tucker Edmister, S., et al. Novel use of FDA-approved drugs identified by cluster analysis of behavioral profiles. Sci Rep. 12 (1), 6120 (2022).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J Neurosci. 27 (18), 4984-4994 (2007).
- Marsden, K. C., Granato, M. In Vivo Ca(2+) Imaging Reveals that Decreased Dendritic Excitability Drives Startle Habituation. Cell Rep. 13 (9), 1733-1740 (2015).
- Chatterjee, P., et al. Otoferlin deficiency in zebrafish results in defects in balance and hearing: rescue of the balance and hearing phenotype with full-length and truncated forms of mouse otoferlin. Mol Cell Biol. 35 (6), 1043-1054 (2015).
- Wang, C., et al. Evaluation of the hair cell regeneration in zebrafish larvae by measuring and quantifying the startle responses. Neural Plast. 2017, 8283075 (2017).
- Xu, L., Guan, N. N., Huang, C. X., Hua, Y., Song, J. A neuronal circuit that generates the temporal motor sequence for the defensive response in zebrafish larvae. Curr Biol. 31 (15), 3343-3357.e4 (2021).
- Hecker, A., Schulze, W., Oster, J., Richter, D. O., Schuster, S. Removing a single neuron in a vertebrate brain forever abolishes an essential behavior. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (6), 3254-3260 (2020).
- Weber, D. N. Dose-dependent effects of developmental mercury exposure on C-start escape responses of larval zebrafish Danio rerio. Journal of Fish Biology. 69 (1), 75-94 (2006).
- Santistevan, N. J., et al. cacna2d3, a voltage-gated calcium channel subunit, functions in vertebrate habituation learning and the startle sensitivity threshold. PLoS One. 17 (7), e0270903 (2022).
- Thyme, S. B., et al. Phenotypic landscape of schizophrenia-associated genes defines candidates and their shared functions. Cell. 177 (2), 478-491.e20 (2019).
- OECD. Test No. 203: Fish, Acute Toxicity Test. OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 2. , (2019).
- Kluver, N., et al. Fish embryo toxicity test: identification of compounds with weak toxicity and analysis of behavioral effects to improve prediction of acute toxicity for neurotoxic compounds. Environ Sci Technol. 49 (11), 7002-7011 (2015).
- Monroe, J. D., et al. Hearing sensitivity differs between zebrafish lines used in auditory research. Hear Res. 341, 220-231 (2016).
- van den Bos, R., et al. Further characterisation of differences between TL and AB zebrafish (Danio rerio): Gene expression, physiology and behaviour at day 5 of the larval stage. PLoS One. 12 (4), e0175420 (2017).
- van den Bos, R., et al. Early life exposure to cortisol in zebrafish (Danio rerio): similarities and differences in behaviour and physiology between larvae of the AB and TL strains. Behavl Pharmacol. 30 (2-3), 260-271 (2019).
- Felsenfeld, A. L., Walker, C., Westerfield, M., Kimmel, C., Streisinger, G. Mutations affecting skeletal-muscle myofibril structure in the zebrafish. Development. 108 (3), 443-459 (1990).
- Berger, J., Sztal, T., Currie, P. D. Quantification of birefringence readily measures the level of muscle damage in zebrafish. Biochem Biophys Res Commun. 423 (4), 785-788 (2012).
- Shahid, M., et al. Zebrafish biosensor for toxicant induced muscle hyperactivity. Sci Rep. 6, 23768 (2016).
- Winter, M. J., et al. Functional brain imaging in larval zebrafish for characterising the effects of seizurogenic compounds acting via a range of pharmacological mechanisms. Br J Pharmacol. 178 (13), 2671-2689 (2021).
- Vorhees, C. V., Williams, M. T., Hawkey, A. B., Levin, E. D. Translating neurobehavioral toxicity across species from zebrafish to rats to humans: Implications for risk assessment. Front Toxicol. 3, 629229 (2021).
- Scholz, S., et al. The zebrafish embryo model in environmental risk assessment–applications beyond acute toxicity testing. Environ Sci Pollut Res Int. 15 (5), 394-404 (2008).
- Dutra Costa, B. P., Aquino Moura, L., Gomes Pinto, S. A., Lima-Maximino, M., Maximino, C. Zebrafish models in neural and behavioral toxicology across the life stages. Fishes. 5 (3), 23 (2020).
- Wolman, M. A., et al. A genome-wide screen identifies PAPP-AA-mediated IGFR signaling as a novel regulator of habituation learning. Neuron. 85 (6), 1200-1211 (2015).
- Marsden, K. C., et al. A Cyfip2-dependent excitatory interneuron pathway establishes the innate startle threshold. Cell Rep. 23 (3), 878-887 (2018).
- Jain, R. A., et al. A forward genetic screen in zebrafish identifies the g-protein-coupled receptor CaSR as a modulator of sensorimotor decision making. Curr Biol. 28 (9), 1357-1369.e5 (2018).
- Nelson, J. C., et al. Acute regulation of habituation learning via posttranslational palmitoylation. Curr Biol. 30 (14), 2729-2738.e4 (2020).
- Meserve, J. H., et al. A forward genetic screen identifies Dolk as a regulator of startle magnitude through the potassium channel subunit Kv1.1. PLoS Genet. 17 (6), e1008943 (2021).
