Een eenvoudige fecale flotatiemethode voor het diagnosticeren van zoönotische nematoden onder veld- en laboratoriumomstandigheden

Gastro-intestinale parasieten zijn een van de meest voorkomende gezondheidsproblemen bij^honden1. Schattingen suggereren dat er wereldwijd ~700 miljoen gedomesticeerde honden zijn, en ongeveer 175 miljoen kunnen worden gecategoriseerd als vrij rondlopend². Meer dan 60 soorten parasieten worden gedeeld tussen honden en mensen, wat suggereert dat honden een bron van infectie kunnen zijn voor mensen met deze parasieten^. Toxocara canis es Ancylostoma caninum zijn twee parasitaire soorten die honden en, per ongeluk, menselijke gastheren infecteren. Momenteel zijn er verschillende onderzoeken naar de locaties waar deze wormen kunnen overleven en zich kunnen voortplanten in Mexico. De prevalentie van Toxocara bij honden varieert van 0% tot meer dan 87% in de Verenigde Staten, Mexico, Midden-Amerika en het Caribisch gebied⁴. Toxocara canis es Ancylostoma spp., evenals andere parasitaire soorten bij honden, zijn eerder gerapporteerd in Mexico 5,6,7,8,9,10,11,12,13 (Tabel 1).

Tabel 1: Regionale prevalentie (%) van hondenparasieten in Mexico van 2001 tot 2020. Bevindingen van eerdere onderzoeken die van 2001 tot 2020 zijn uitgevoerd, hebben de identificatie van de verspreiding van hondenparasieten in verschillende stedelijke en landelijke omgevingen in Mexico mogelijk gemaakt. Deze studies bieden een diepgaand inzicht in epidemiologische elementen die bevorderlijk zijn voor de persistentie van hondenparasieten in verschillende ecosystemen, en dragen bij aan een uitgebreide beoordeling van de zoönotische impact van sommige parasietsoorten.

Levenscyclusstadia van darmparasieten, zoals eieren, cysten, oöcysten of larven, zijn te vinden in ontlastingsmonsters. Onderzoek van fecaal materiaal levert dus waardevolle informatie op over de parasieten van een dier. De behoefte aan een methode om Ancylostomidae-eieren in menselijke uitwerpselen te detecteren, leidde in 1878 tot het gebruik van het eenvoudige uitstrijkje, dat jarenlang werd gebruikt om gastro-intestinale parasieten op te sporen, maar als niet erg gevoelig werd beschouwd. Zo ontstond de behoefte om betere copromicroscopische methoden te ontwikkelen¹⁴. Er zijn meer dan 100 jaar verstreken sinds de flotatietechniek voor het herstellen en tellen van parasieteneieren in fecale monsters voor het eerst werd beschreven¹⁵. Sindsdien worden verschillende methoden en varianten van de flotatietechniek beschouwd als een standaard voor de detectie van sommige parasieten in hun gastheren.

Zo beschreef Lane in 1924 een methode met de directe centrifugale flotatietechniek, waarbij centrifugatie wordt geïntegreerd gevolgd door het drijven van het sediment in een verzadigde natriumchloride-oplossing met SpG 1,2 in 1 g (Lane) of 10 g (Stoll’s modificatie). De flotatietechniek werd vervolgens aangepast door gebruik te maken van oplossingen met verschillende SpG¹⁴. In 1939 rapporteerden Gordon en Whitlock de nadelen van de techniek van Stoll als gevolg van interferentie van afval bij het visualiseren van parasieteneieren en ontwikkelden ze de kwantitatieve methode die bekend staat als McMaster¹⁶. In 1979 toonden O’Grady en Slocombe aan dat het soortelijk gewicht van de oplossing, timing en maaswijdten van zeven van invloed zijn op de nauwkeurigheid van de detectie van eieren met behulp van de flotatietechniek¹⁷. In de afgelopen decennia is er, omdat er verschillende wijzigingen zijn aangebracht in de flotatietechniek, dringend behoefte aan standaardisatie van flotatiemethoden. Momenteel is detectie van worminfecties bij honden in het kader van de preventie van zoönotische parasieten vereist om passende anthelmintische behandelingen toe te passen om milieuverontreiniging met infectieuze stadia van zoönotische nematoden te beperken¹⁸.

Van de kwalitatieve methoden wordt de fecale flotatietechniek veel gebruikt en geaccepteerd omdat er niet veel apparatuur voor nodig is, eenvoudig, goedkoop en reproduceerbaar is; Toch heeft het een groot nadeel dat het niet gevoelig is wanneer de intensiteit van de infectie laag is¹⁹. Het vermogen om de aanwezigheid van een groter aantal parasitaire elementen zoals eieren, oöcysten, cysten of nematodenlarven aan te tonen, wordt meestal bepaald door de dichtheid van de oplossing²⁰.

In eerdere rapporten zijn coproparasitologische technieken voor de detectie van eitjes van hondenaaltjes vergeleken. Met betrekking tot de detectie van beweeglijke protozoa worden directe fecale uitstrijkjes gebruikt; terwijl sedimentatiemethoden nuttig zijn voor het diagnosticeren van zware eieren van parasieten zoals trematoden²¹. Een van de meest gebruikte diagnostische tests in het veld is de fecale uitstrijkmethode. Het lage gevoeligheidsniveau van deze techniek kan echter worden toegeschreven aan het feit dat het puin bevat dat de detectie van parasieteneieren verstoort. Door een zeefstap op te nemen in combinatie met oplossingen die de juiste SpG bieden, biedt de flotatiemethode een duidelijkere en minder rommelige observatie van ascarid- en haakwormeieren. Dit leidt tot een nauwkeuriger en efficiënter proces voor microscopische screening²². Evenzo worden eenvoudige flotatie- en directe centrifugale flotatietechnieken zeer vaak gebruikt om parasieteneieren en oöcysten te^herstellen14. De klassieke flotatiemethoden kunnen als kwalitatief of kwantitatief worden beschouwd, afhankelijk van het gebruik van een telkamer zoals de McMaster-methode¹⁵. Aangezien de flotatietechniek echter een lage gevoeligheid heeft en zich richt op de detectie van parasieten tijdens de octrooiperiode, mogen negatieve resultaten niet als overtuigend worden beschouwd. De nauwkeurigheid hangt echter niet alleen af van de conserveringsprocedure van fecale monsters of de SpG van flotatieoplossingen, maar hangt ook af van de technische vaardigheid en ervaring met het uitvoeren van fecale onderzoeken van de gebruiker.

Daarom zijn andere methoden onderzocht voor de detectie van hondenparasieten in ontlasting. Het is algemeen erkend dat een van de meest gebruikte benaderingen voor de diagnose van intestinale worminfecties bij honden de FLOTAC-techniek is, een multivalente, gevoelige en nauwkeurige methode die nauwkeurige en betrouwbare resultaten oplevert voor de diagnose van A. caninum bij honden in vergelijking met een flotatieprotocol in een buis en de McMaster-techniek^{19, 23}. okt. Sedimentatiemethoden zijn nuttig voor het terugwinnen van boteieren, bevruchte nematodeneieren en de meeste lintwormeieren, die niet kunnen worden teruggevonden op het oppervlak van een flotatieoplossing omdat deze structuren niet drijven²⁴. Een methode waarvan is bewezen dat deze superieur is aan flotatie-/sedimentatietechnieken is de gemodificeerde dubbele centrifugale flotatiemethode, omdat deze de detectie van cestode-eieren in uitwerpselen mogelijk maakt, minder tijdrovend is, Anoplocephala-eieren scheidt van fecaal afval en kristallisatie vermindert²⁵. Bovendien is deze techniek met succes gebruikt om ascarid-eieren met een hoge gevoeligheid te detecteren²⁶. Toch vereisen sommige van deze bovengenoemde technieken en centrifugale methoden zoals de Ovassay, in tegenstelling tot het flotatieprotocol dat we in deze studie voorstellen, monsterbewaring in reagentia zoals formaline, commerciële kits, monsterverwerking onder laboratoriumomstandigheden en het gebruik van reagentia zoals zinksulfaat²⁷ die duur zijn en speciale verwijderingsprocedures vereisen om milieutoxiciteit te voorkomen.

Het gebruik van technieken die de gevoeligheid van de flotatiemethode verhogen door oplossingen met een hoge SpG toe te voegen, heeft de laatste tijd de voorkeur. Er moet echter rekening mee worden gehouden dat het nadeel van deze oplossingen de toename van puin in de uiteindelijke bereiding is en dus de onnauwkeurige detectie van parasieteneieren. Bovendien zijn de commerciële beschikbaarheid van materialen, reagentia, kosten, milieu-impactkwesties en de moeilijkheid van het gebruik van centrifugale methoden van invloed op de selectie van een flotatietechniek¹⁴, die in veldomstandigheden een uitdaging kan zijn in tegenstelling tot het protocol dat we in dit werk presenteren. De bereiding van de flotatieoplossingen met keukenzout is voordeliger dan het gebruik van suiker, omdat suiker onder veldomstandigheden insecten zoals wespen en bijen aantrekt en preparaten plakkerig worden. Verder zijn oplossingen zoals fenol, dat wordt toegevoegd aan suikeroplossingen om plakkerigheid te voorkomen, of ZnSO₄complex om op de juiste manier weg te gooien volgens de richtlijnen voor milieubescherming en kunnen ze niet in het veld worden weggegooid; in tegenstelling tot een keukenzoutoplossing.

Het doel van dit manuscript is om de stappen te demonstreren om T. canis es Ancylostoma spp. eieren in fecale monsters te detecteren met behulp van een aanpassing van de eenvoudige flotatietechniek onder veld- en laboratoriumomstandigheden. Volgens het hierbij beschreven protocol en met behulp van een microscoop met een back-upbatterij, is de diagnose van deze zoönotische parasieten bij honden in landelijke en voorstedelijke gebieden mogelijk wanneer er geen laboratoriumapparatuur en infrastructuur beschikbaar zijn. De eenvoudige flotatiemethode die in dit werk wordt beschreven, kan snelle resultaten opleveren en is een niet-invasieve en kosteneffectieve techniek voor routinematige screening.