Aquí se presenta un protocolo detallado para aislar y caracterizar poblaciones microambientales de médula ósea a partir de modelos murinos de síndromes mielodisplásicos y leucemia mieloide aguda. Esta técnica identifica cambios en el nicho de la médula ósea no hematopoyética, incluidas las células endoteliales y mesenquimales del estroma, con progresión de la enfermedad.
El microambiente de la médula ósea está formado por distintas poblaciones celulares, como las células estromales mesenquimales, las células endoteliales, las células del linaje osteológico y los fibroblastos, que proporcionan soporte a las células madre hematopoyéticas (CMH). Además de apoyar las HSC normales, el microambiente de la médula ósea también desempeña un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los síndromes mielodisplásicos (SMD) y la leucemia mieloide aguda (LMA). Las mutaciones asociadas a los SMD en las CMH conducen a un bloqueo en la diferenciación y a una insuficiencia progresiva de la médula ósea, especialmente en los ancianos. A menudo, los SMD pueden progresar a LMA resistente a la terapia, una enfermedad caracterizada por una rápida acumulación de blastocitos mieloides inmaduros. Se sabe que el microambiente de la médula ósea está alterado en pacientes con estas neoplasias mieloides. En este trabajo se describe un protocolo completo para aislar y caracterizar fenotípicamente células microambientales de la médula ósea a partir de modelos murinos de síndrome mielodisplásico y leucemia mieloide aguda. Aislar y caracterizar los cambios en las poblaciones del nicho de la médula ósea puede ayudar a determinar su papel en el inicio y la progresión de la enfermedad y puede conducir al desarrollo de nuevas terapias dirigidas a las alteraciones promotoras del cáncer en las poblaciones del estroma de la médula ósea.
El microambiente de la médula ósea está formado por células hematopoyéticas, células estromales no hematopoyéticas y la matriz extracelular 1,2. Este microambiente puede promover la autorrenovación de las células madre hematopoyéticas, regular la diferenciación del linaje y proporcionar soporte estructural y mecánico al tejido óseo 1,2,3,4,5. El nicho estromal incluye células osteolinajes, fibroblastos, células nerviosas y células endoteliales6, mientras que el nicho hematopoyético está formado por las poblaciones linfoides y mieloides 1,2,3. Además de apoyar las CMH normales, el microambiente de la médula ósea también puede desempeñar un papel en el desarrollo de trastornos de las células madre hematopoyéticas, como los SMD y la LMA 7,8,9,10,11. Se ha demostrado que las mutaciones en las células del linaje osteológico promueven el desarrollo de SMD, LMA y otras neoplasias mieloproliferativas 10,12,13,14.
Los síndromes mielodisplásicos son un grupo de trastornos preleucémicos que surgen de mutaciones en las células madre hematopoyéticas. El SMD se asocia con frecuencia con un bloqueo en la diferenciación de las HSC y la producción de células displásicas, lo que a menudo puede conducir a insuficiencia de la médula ósea. El SMD es la neoplasia mieloide más comúnmente diagnosticada en los Estados Unidos y se asocia con una tasa de supervivencia a 3 años del 35% al 45%15. Los SMD a menudo se asocian con un alto riesgo de transformación a leucemia mieloide aguda. Esto puede ser una complicación mortal, ya que la LMA derivada de SMD es resistente a la mayoría de las terapias y es probable que recaiga. La LMA que surge de novo debido a translocaciones o mutaciones en el tallo hematopoyético y los progenitores también suele ser resistente a la quimioterapia estándar16,17. Dado que los SMD y la LMA son principalmente enfermedades de los ancianos, y la mayoría se diagnostican después de los 60 años, la mayoría de los pacientes no son elegibles para trasplantes curativos de médula ósea. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Dado que el microambiente de la médula ósea puede proporcionar apoyo a las células malignas14, la definición de los cambios en el nicho de la médula ósea con la progresión de la enfermedad puede conducir a la identificación de nuevas terapias destinadas a inhibir la remodelación del nicho tumoral. Por lo tanto, existe una necesidad significativa de identificar nuevos reguladores de la progresión de la enfermedad. Con este fin, es fundamental identificar y caracterizar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea que pueden proporcionar apoyo a las células malignas.
Se han generado varios modelos murinos de LMA y SMD que pueden utilizarse para estudiar los cambios en el microambiente de la médula ósea durante el inicio y la progresión de la enfermedad 6,1,19,20,21,22. En este trabajo se describen los protocolos para identificar los cambios en las poblaciones de células estromales de la médula ósea utilizando modelos murinos de LMA inducida por retrovirales 6,20, así como el modelo Nup98-HoxD13 (NHD13) disponible comercialmente de transformación de SMD de alto riesgo a LMA19. Los ratones trasplantados con células de LMA de novo sucumben a la enfermedad en 20-30 días6. Los ratones NHD13 desarrollan citopenias y displasia de médula ósea alrededor de las 15-20 semanas, que finalmente se transforma en LMA, y casi el 75% de los ratones sucumben a la enfermedad alrededor de las 32 semanas. Para analizar las poblaciones de microambiente de médula ósea modelo murino, se recolectan huesos, se digieren médula ósea y espículas óseas mediante digestión enzimática, y luego se enriquecen las células para poblaciones no hematopoyéticas CD45-/Ter119- mediante clasificación magnética. Si bien se han descrito previamente análisis similares 11,13,22,23,24,25, a menudo se centran en la médula ósea o en el hueso y no incorporan células de ambas fuentes en sus análisis. La caracterización combinada de estas poblaciones, junto con los análisis de expresión génica, puede proporcionar una comprensión completa de cómo el microambiente hematopoyético celular proporciona apoyo para el inicio y la progresión de la enfermedad (Figura 1). Si bien el protocolo que se describe a continuación se centra en el modelo de LMA inducida por retrovirales y en un modelo genético de SMD, estas estrategias se pueden adaptar fácilmente para estudiar los cambios en el nicho de la médula ósea de cualquier modelo murino de interés.
Los modelos de leucemia murina se han utilizado ampliamente para identificar señales intrínsecas y de nicho celular que promueven la progresión agresiva de la leucemia mieloide 6,19,21. Aquí, se presenta un protocolo integral basado en citometría de flujo para definir la composición celular del microambiente de la médula ósea en modelos murinos de SMD y LMA.
Antes de adquirir datos de citometr…
The authors have nothing to disclose.
Nos gustaría agradecer al Núcleo de Citometría de Flujo del URMC. Este trabajo fue apoyado por el Premio Académico de la Sociedad Americana de Hematología, el Premio de la Fundación para la Investigación de la Leucemia y las subvenciones de los NIH R01DK133131 y R01CA266617 otorgadas a J.B.
1 mL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-165RL | |
1.7 mL Microcentrifuge Tubes | AVANT | L211511-CS | |
10 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-140RL | |
10 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1760 | |
1000 mL Vacuum Filtration Flask | NEST | 344021 | |
15 mL Centrifuge Tube | VWR | 10026-076 | |
2 mL Aspirating Pipette | NEST | 325011 | |
200 µL pipette Tips | Genesee Scientific | 24-150-RL | |
25 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1780 | |
5 mL Individually Wrapped Sterile Serological Pipettes | Globe scientific | 1740 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube 12 x 75 mm style | Falcon | 352054 | |
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube with Cell Strainer Cap 12 x 75 mm style | Falcon | 352235 | |
50 mL Centrifuge Tube | NEST | 602052 | |
6 Well, Flat Bottom with Low Evaporation Lid | Falcon | 353046 | |
Absorbent Underpads with Waterproof Moisture Barrier | VWR | 56616-031 | |
APC MicroBeads | Miltenyi | 130-090-855 | |
autoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 4425745 | |
BD Pharmingen Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) | BD Biosciences | 553141 | 0.5 mg/mL |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | 66.000 g/mol |
Brilliant Violet 421 anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) Antibody (D7) | Invitrogen | 404-5981 | 0.2 mg/mL |
C57BL/6J Mice | Jackson Laboratory | 664 | |
Carbon Dioxide Gas Tank | Airgas | CD50 | |
CD31 (PECAM-1) Monoclonal Antibody (390), PE-Cyanine7 | Invitrogen | 25-0311-82 | 0.2 mg/mL |
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC | Invitrogen | 17-0451-82 | 0.2 mg/mL |
Cell Strainer 70 µm Nylon | Falcon | 352350 | |
Cole-Parmer Essentials Mortar and Pestle; Agate, 125 mL | Cole-Parmer | EW-63100-62 | |
Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C5138-500MG | |
Collagenase Type I | STEMCELL | 7415 | |
Corning Mini Centrifuge | CORNING | 6770 | |
Corning Stripettor Ultra Pipet Controller | Corning | 4099 | |
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D4513 | |
Dispase II, powder | Gibco | 117105041 | |
DPBS 10x | gibco | 14200-075 | |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 00-4333-57 | |
Ethanol absolute, KOPTEC, meets analytical specification of BP, Ph. Eur., USP (200 Proof) | VWR | 89125-174 | |
Fine scissors – sharp | Fine Science Tools | 14061-10 | |
Foundation B Fetal Bovine Serum | GeminiBio | 900-208 | |
Gilson PIPETMAN L Pipette Starter Kits | FisherScientific | F167370G | |
Graefe Forceps | Fine Science Tools | 11051-10 | |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) 10x | gibco | 14185-052 | |
Hemocytometer | Fisher | 02-671-10 | |
Incubator | BINDER | C150-UL | |
Kimwipes | KIMTECH | K222101 | |
LABGARD Class II, Type A2 Biological Safety Cabinet | Nuaire | NU-425-400 | |
LD Columns | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-901 | |
LSE Vortex Mixer | CORNING | 6775 | |
LSRII/Fortessa/Symphony A1 | Becton, Dickinson and Company | 647800L6 | |
MACS MULTI STAND | Miltenyi Biotec GmBH | 130-042-303 | |
MACsmix Tube Rotator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-753 | |
mIgG | Millipore-Sigma | 18765-10mg | 2 mg/mL |
Nup98-HoxD13 (NHD13) Mice | Jackson Laboratory | 010505 | |
PE anti-mouse CD51 Antibody (RMV-7) | Biolegend | 104106 | 0.2 mg/mL |
PE/Cyanine5 anti-mouse CD140a Antibody (RUO) | Biolegend | 135920 | 0.2 mg/mL |
Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | 10,000 U/mL |
Plastipak 3 mL Syringe | Becton, Dickinson and Company | 309657 | |
Propidium Iodide – 1.0 mg/mL Solution in Water | ThermoFisher Scientific | P3566 | |
QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec GmBH | 130-090-976 | |
Sorvall X Pro / ST Plus Series Centrifuge | Thermo Scientific | 75009521 | |
TER-119 Monoclonal Antibody (TER-119), APC | Invitrogen | 17-5921-82 | 0.2 mg/mL |
Trypan Blue Solution 0.4% | Gibco | 15-250-061 | |
Ultrapure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Invitrogen | 15575-038 |