Este protocolo describe una plataforma de cultivo celular basada en membranas reconfigurable que integra el formato de pozo abierto con capacidades de flujo de fluidos. Esta plataforma es compatible con los protocolos estándar y permite transiciones reversibles entre los modos de cultivo microfluídico y de pozo abierto, adaptándose a las necesidades de los laboratorios de ingeniería y biociencias.
Los sistemas microfisiológicos son plataformas de cultivo celular miniaturizadas que se utilizan para imitar la estructura y la función de los tejidos humanos en un entorno de laboratorio. Sin embargo, estas plataformas no han obtenido una adopción generalizada en los laboratorios de biociencias, donde los enfoques basados en membranas de pozo abierto sirven como el estándar de oro para imitar las barreras tisulares, a pesar de carecer de capacidades de flujo de fluidos. Este problema se puede atribuir principalmente a la incompatibilidad de los sistemas microfisiológicos existentes con los protocolos y herramientas estándar desarrollados para los sistemas de pozos abiertos.
Aquí, presentamos un protocolo para crear una plataforma reconfigurable basada en membranas con una estructura de pozo abierto, capacidad de mejora de flujo y compatibilidad con protocolos convencionales. Este sistema utiliza un enfoque de ensamblaje magnético que permite la conmutación reversible entre los modos de pozo abierto y microfluídico. Con este enfoque, los usuarios tienen la flexibilidad de comenzar un experimento en el formato de pozo abierto utilizando protocolos estándar y agregar o eliminar capacidades de flujo según sea necesario. Para demostrar el uso práctico de este sistema y su compatibilidad con las técnicas estándar, se estableció una monocapa de células endoteliales en un formato de pocillo abierto. El sistema se reconfiguró para introducir el flujo de fluidos y luego se cambió al formato de pozo abierto para realizar la inmunotinción y la extracción de ARN. Debido a su compatibilidad con los protocolos convencionales de pozos abiertos y su capacidad de mejora del flujo, se espera que este diseño reconfigurable sea adoptado tanto por los laboratorios de ingeniería como por los de biociencias.
Las barreras vasculares sirven como una interfaz crítica que separa el compartimento sanguíneo del tejido circundante. Desempeñan un papel fundamental en la preservación de la homeostasis al atraer células inmunitarias, controlar la permeabilidad molecular y proteger contra la intrusión de patógenos en el tejido 1,2. Se han desarrollado modelos de cultivo in vitro para imitar el microambiente in vivo, lo que permite realizar investigaciones sistemáticas sobre los factores y condiciones que afectan las propiedades de barrera tanto en estados sanos como enfermos 3,4.
El enfoque más utilizado para estos modelos de cultivo es la configuración de “pozo abierto”5 similar a Transwell, en la que una membrana de cultivo porosa y grabada separa los compartimentos llenos de medios (Figura 1A). En este formato, las células se pueden sembrar a ambos lados de la membrana, y se ha desarrollado una amplia gama de protocolos experimentales. Sin embargo, estos sistemas tienen una capacidad limitada para proporcionar los flujos de fluidos esenciales para apoyar la maduración de la barrera e imitar la circulación de las células inmunitarias observadas in vivo 5,6. En consecuencia, no pueden ser utilizados para estudios que requieran flujos dinámicos que introduzcan dosis de fármacos, estimulación mecánica o tensiones de cizallamiento inducidas por fluidos 6,7,8.
Para superar las limitaciones de los sistemas de pozos abiertos, se han desarrollado plataformas microfluídicas que combinan membranas de cultivo porosas con canales fluídicos direccionables individualmente9. Estas plataformas ofrecen un control preciso sobre el enrutamiento de fluidos, la perfusión y la introducción de compuestos químicos, estimulación de cizallamiento controlada y capacidades de adición celular dinámica 7,10,11,12,13. A pesar de las capacidades avanzadas proporcionadas por las plataformas microfluídicas, no han sido ampliamente adoptadas en los laboratorios de biociencias debido a los complejos protocolos microfluídicos y su incompatibilidad con los flujos de trabajo experimentales establecidos 4,10,14.
Para cerrar la brecha entre estas tecnologías, presentamos un protocolo que emplea un sistema basado en módulos reconfigurable magnéticamente. Este sistema se puede cambiar fácilmente entre los modos de pozo abierto y microfluídico en función de las necesidades específicas del experimento. La plataforma cuenta con un dispositivo de pozo abierto, conocido como m-μSiM (sistema microfisiológico modular habilitado por una membrana de silicio), con una membrana de cultivo de 100 nm de espesor (nanomembrana). Esta nanomembrana posee una alta porosidad (15%) y una transparencia similar a la del vidrio, como se ilustra en la Figura 1B. Separa físicamente el compartimento superior de un canal inferior, lo que permite el transporte molecular a través de escalas de longitud fisiológicas15. A diferencia de las membranas convencionales grabadas con trazas, que tienen desafíos conocidos en la obtención de imágenes de células vivas con imágenes de campo claro, las propiedades ópticas y físicas favorables de la nanomembrana permiten una visualización clara de las células a ambos lados de la superficie de la membrana 15,16,17.
El presente protocolo describe la fabricación de módulos especializados de siembra y flujo y explica la reconfiguración magnética de la plataforma. Demuestra cómo se puede emplear la plataforma para establecer barreras endoteliales tanto en condiciones estáticas como dinámicas. Esta demostración revela que las células endoteliales se alinean a lo largo de la dirección del flujo, con una regulación positiva de las dianas genéticas sensibles al cizallamiento bajo la estimulación del cizallamiento.
El objetivo de este protocolo es desarrollar un método práctico para incorporar capacidades de flujo en una plataforma de pozo abierto con una nanomembrana ultrafina. En este diseño, se utiliza un enfoque de enclavamiento magnético, lo que permite cambiar entre los modos de pozo abierto y fluídico durante los experimentos y combinar las ventajas de ambos enfoques. A diferencia de las plataformas convencionales unidas permanentemente, el cierre magnético permite desmontar la plataforma en puntos convenientes durante…
The authors have nothing to disclose.
Esta investigación fue financiada en parte por el Instituto Nacional de Salud (NIH, por sus siglas en inglés) bajo los números de adjudicación R43GM137651, R61HL154249, R16GM146687 y la subvención CBET de la NSF 2150798. Los autores agradecen a RIT Machine Shop por la fabricación de moldes de aluminio. El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
0.5 x 0.86 Micro Flow tubes | Langer Instruments | WX10-14 & DG Series | |
1 mm Disposable Biopsy Punches, Integra Miltex | VWR | 95039-090 | |
1x PBS 7.4 pH | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
20 GAUGE IT SERIES DISPENSING TIP | Jensen Global | JG20-1.5X | |
21 GAUGE NT PREMIUM SERIES ANGLED DISPENSING TIP | Jensen Global | JG21-1.0HPX-90 | |
3M 467 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9726-ND | |
3M 468 MP Pressure senstitive adhesive (PSA) | DigiKey | 3M9720-ND | |
AlexaFluor 488 conjugated phalloidin | ThermoFisher Scientific | A12379 | |
Applied Biosystems TaqMan Fast Advanced Master Mix | Thermo Fisher Scientific | 4444556 | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent grade, Alfa Aesar, Size = 10 g | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K171 | 12" x 12" x 1/16" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8589K31 | 12" x 12" x 3/32" |
Clear Scratch- and UV-Resistant Cast Acrylic Sheet | McMaster-Carr | 8560K191 | 12" x 12" x 7.64" |
Corning Fibronectin, Human, 1 mg | Corning | 47743-728 | |
Cover Glasses, Globe Scientific, L x W = 24 x 60 mm | VWR | 10118-677 | |
DOW SYLGARD 184 SILICONE ENCAPSULANT CLEAR 0.5 KG KIT | Ellsworth Adhesives | 4019862 | |
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
Fixture A1&A2 | SiMPore Inc. | NA | |
Fixture B1&B2 | SiMPore Inc. | NA | |
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit with RNase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 4374966 | |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) | ThermoFisher Scientific | C0035C | |
LIVE/DEAD Cell Imaging Kit (488/570) | Thermo Fisher Scientific | R37601 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nickel-plated magnets (4.75 mm diameter, 0.34 kg pull force) | K&J Magnetics | D31 | 3/16" dia. x 1/16" thick |
Paraformaldehyde, 4% w/v aq. soln., methanol free, Alfa Aesar | Fisher Scientific | aa47392-9M | |
Peristaltic Pump | Langer Instruments | BQ50-1J-A | |
Photoresist SU-8 developer solution | Fisher Scientific | NC9901158 | |
PVDF syringe filters | PerkinElmer | 2542913 | |
Silicon wafer | University wafer,USA | 1196 | |
SU-8 3050 | Fisher Scientific | NC0702369 | |
Target gene: eNOS (Hs01574659_m1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: GAPDH (Hs02786624_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Target gene: KLF2 (Hs00360439_g1) | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352 | |
Transport Tube Sample White caps, 5 mL, Sterile | VWR | 100500-422 | |
TRI-reagent | ThermoFisher Scientific | AM9738 | |
Ultrathin Nanoporous Membrane Chip | SiMPore Inc. | NPSN100-1L | The design is compatible with all of SiMPore membranes |
uSiM component 1 | SiMPore Inc. | NA | |
uSiM component 2 | SiMPore Inc. | NA |