Aquí, describimos una herramienta avanzada diseñada para el monitoreo de la biosíntesis de clorofila durante las primeras etapas de la desetiolación de plántulas de Arabidopsis . La novedosa metodología proporciona imágenes no invasivas de fluorescencia de clorofila en tiempo real a alta resolución espacial y temporal.
La biosíntesis de clorofila es un sello distintivo de la desetiolación, una de las etapas más dramáticas en el ciclo de vida de las plantas. El proceso de biosíntesis de clorofila, estrechamente controlado y altamente dinámico, se desencadena durante el cambio de la oscuridad a la luz en las plantas con flores. En el momento en que las plántulas etioladas se exponen a los primeros rastros de luz solar, la conversión rápida (en orden de segundos) de protoclorofilida en clorofilia está mediada por complejos proteicos únicos que aceptan la luz, lo que conduce a través de pasos metabólicos posteriores a la producción de clorofila completamente funcional. Las técnicas estándar para el análisis del contenido de clorofila incluyen la extracción de pigmentos de tejidos vegetales desprendidos, lo que no se aplica al estudio de procesos tan rápidos. Para investigar la cinética de la clorofila in vivo con alta precisión y resolución espacio-temporal en las primeras horas después de la desetiolación inducida por la luz, se desarrollaron un instrumento y un protocolo. Aquí, presentamos un procedimiento detallado diseñado para la cuantificación estadísticamente robusta de clorofila en las primeras etapas de la desetiolación de Arabidopsis .
La desetiolación representa la fase más dramática del ciclo de vida de las plantas, caracterizada por una serie de cambios morfológicos y un reordenamiento completo del metabolismo de las plantas (de hetero a autotrópico)1. La biosíntesis de clorofila es un sello distintivo de la desetiolación inducida por la luz en las plantas y un proceso muy dinámico. La formación de clorofila a partir de protoclorofilida, precursora producida en la oscuridad, debe coordinarse estrechamente para evitar daños debidos a subproductos reactivos2. La reducción de protoclorofílidos a clorofilida es catalizada por protoclorofilidos oxidorreductasas dependientes de la luz (POR), enzimas únicas activadas directamente por la luz. La reacción es muy rápida, teniendo lugar en el orden de ms a s3, lo que lleva a una acumulación de clorofila reconocible en cuestión de minutos después de la irradiación etiolada de las plántulas 4,5,6. Se requiere más tiempo (de horas a días) para que la biogénesis del cloroplasto establezca un aparato fotosintético completamente funcional3.
Existen varios métodos para analizar el contenido de clorofila, incluida la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) o la espectrofotometría. Por lo general, estas técnicas exigen la destrucción del tejido vegetal 4,5,6, lo que restringe la determinación de los cambios en los niveles de clorofila a lo largo del tiempo. Los métodos que permiten el establecimiento de la cinética de clorofila no invasiva pueden abrir una perspectiva completamente nueva para estudiar las plantas en diversos aspectos que van desde preguntas de investigación fundamentales, como el análisis del proceso de síntesis de clorofila en el tiempo y el espacio, hasta aplicaciones más prácticas, como la evaluación de la tolerancia al estrés o el efecto de los bioestimulantes en la cinética de la clorofila. Teniendo esto en cuenta, introdujimos un sistema para monitorear la formación de clorofila, iReenCAM7. Incorpora una cámara CCD, filtros de emisión, fuentes de luz y una tubería para el análisis automatizado de fluorescencia (Figura 1). La característica principal del dispositivo desarrollado es la alta resolución espacial y temporal, que supera los parámetros utilizados en los enfoques actuales, y la sensibilidad y especificidad suficientes en comparación con los métodos analíticos estándar7.
El procedimiento no invasivo aquí descrito requiere un mínimo de reactivos y comprende pasos simples, lo que permite obtener un perfil cinético de clorofila en plántulas vivas de Arabidopsis durante etapas muy tempranas de desetiolación. El protocolo puede ser útil para el estudio de procesos altamente dinámicos de síntesis de clorofila influenciados por una serie de factores, tanto exógenos (sal, sequía, bioestimulantes, metales pesados, etc.) como endógenos (típicamente asociados a cambios en la actividad génica) de origen sin necesidad de desprender ningún tejido vegetal, evitando así estrés adicional.
Pasos críticos del protocolo y solución de problemas: no hay luz y se cuida la mascarilla
Como se destaca directamente en la descripción del protocolo anterior, es de vital importancia evitar incluso las pequeñas cantidades de luz tanto durante el cultivo de plántulas de plantas etioladas como justo antes de comenzar el protocolo11. En nuestra configuración, utilizamos una cámara oscura dedicada ubicada en el fitotrón de entrada y separada del resto del fitotrón con un…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue financiado por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional-Proyecto SINGING PLANT (No. CZ.02.1.01/0,0/0,0/16_026/0008446). Este proyecto ha recibido financiación a través del proyecto MSCA4Ukraine (ID 1233580), financiado por la Unión Europea. Agradecemos a Lenka Sochurkova por el diseño gráfico de la Figura 1.
6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
Cultivation chamber | PSI | custom made | |
Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
Petri plates – Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |