Las interacciones proteína-proteína son importantes para dilucidar la función de las proteínas diana, y la coinmunoprecipitación (co-IP) puede confirmar fácilmente los IBP. Transfectamos transitoriamente un plásmido que codifica una proteína marcada con un epítopo en células HEK-293 y desarrollamos un método de inmunoprecipitación para confirmar fácilmente la unión de dos proteínas objetivo.
Las interacciones proteína-proteína (IBP) desempeñan un papel fundamental en los fenómenos biológicos, como la organización celular, la transducción de señales intracelulares y la regulación transcripcional. Por lo tanto, la comprensión de los IBP es un punto de partida importante para una mayor investigación de la función de la proteína diana. En este estudio, proponemos un método simple para determinar la unión de dos proteínas diana mediante la introducción de vectores de expresión de mamíferos en células HEK-293 utilizando el método de polietilenimina, lisando las células en un tampón de lisis de proteínas casero y tirando de las proteínas diana en un gel de afinidad de etiqueta de epítopo. Además, el PPI entre las diversas proteínas fusionadas con la etiqueta del epítopo puede confirmarse mediante el uso de anticuerpos de afinidad contra cada etiqueta en lugar del gel de afinidad de la etiqueta del epítopo. Este protocolo también podría utilizarse para verificar varios IBP, incluidos extractos nucleares, de otras líneas celulares. Por lo tanto, se puede utilizar como método básico en una variedad de experimentos de PPI. Las proteínas se degradan por un curso de tiempo prolongado y ciclos repetidos de congelación y descongelación. Por lo tanto, la lisis celular, la inmunoprecipitación y la inmunotransferencia deben realizarse de la manera más fluida posible.
Las proteínas desempeñan un papel importante en todas las funciones celulares, incluido el procesamiento de la información, el metabolismo, el transporte, la toma de decisiones y la organización estructural. Las proteínas median sus funciones interactuando físicamente con otras moléculas. Las interacciones proteína-proteína (IBP) son importantes para mediar las funciones celulares, como la mediación de la transducción de señales, la detección del entorno, la conversión de energía en movimiento físico, la regulación de la actividad de las enzimas metabólicas y de señalización, y el mantenimiento dela organización celular. Por lo tanto, los IBP se pueden utilizar para dilucidar funciones desconocidas2. Los métodos para detectar IBP se pueden clasificar en tres tipos: in vitro, in vivo e in silico. Para la detección in vitro de IBP se han utilizado la coinmunoprecipitación (co-IP), la cromatografía de afinidad, la purificación por afinidad en tándem, las matrices de proteínas, la visualización de fagos, la complementación de fragmentos de proteínas, la cristalografía de rayos X y la espectroscopia de resonancia magnética nuclear3. Entre estos métodos, la co-IP es ampliamente utilizada debido a su simplicidad.
La etiqueta de fusión FLAG consta de ocho aminoácidos (AspTyrLysAspAspAspAspLys: DYKDDDDK), incluido un sitio de escisión de enteroquinasa, y fue diseñada específicamente para la cromatografía de inmunoafinidad4. Las proteínas marcadas con DYKDDDDK se reconocen y capturan mediante un anticuerpo anti-DYKDDDDK. Por lo tanto, se reducen de manera eficiente utilizando perlas de agarosa de unión DYKDDDDK5 para confirmar su unión a proteínas específicas de una manera simple. La inmunoprecipitación se puede realizar en una variedad de células, y una amplia gama de IBP se puede confirmar utilizando anticuerpos contra la proteína de interés. La inmunoprecipitación y la elución de péptidos con perlas de agarosa anti-DYKDDDDK han sido reportadas previamente5.
Aquí, proporcionamos un método de inmunoprecipitación simple en el que un plásmido que codifica una proteína marcada con DYKDDDDK se introduce transitoriamente en las células HEK-293 para confirmar la asociación de dos proteínas de interés. Ciertos anticuerpos DYKDDDDK pueden unirse tanto al extremo N-terminal como al extremo C-terminal de las proteínas de fusión, pero no a otros6. Por lo tanto, para evitar confusiones, se debe elegir el anticuerpo que reconoce la etiqueta fusionada con los extremos N y C. Al insertar una etiqueta de epítopo, puede ser posible evitar cambios conformacionales en la proteína insertando de 3 a 12 pares de bases entre la etiqueta de epítopo y la proteína objetivo. Sin embargo, la secuencia insertada debe ser un par de bases en múltiplos de 3 para evitar el cambio de marco.
Este protocolo es casi iguala los protocolos 5,7,14,15 reportados anteriormente. El punto importante de este protocolo es que nunca detenemos el experimento desde la etapa de lisis celular hasta la etapa de inmunoprecipitación. La degradación de proteínas dificulta la detección de IBP. El curso de tiempo prolongado y los ciclos repetidos de congelación y descongelación degradan las prote?…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSPS) KAKENHI Grant Number 19K18008 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K16415 (G.N.), JSPS KAKENHI Grant Number 22K08672 (H.O.), Japan Diabetes Society Research Grant for Young Investigators (G.N.) y MSD Life Science Foundation Research Grant for Young Investigators (G.N.).
0.5 M EDTA (pH8.0) | Nippon gene | 311-90075 | |
10% Mini-PROTEAN TGX Precast Protein Gels, 10-well, 50 µL | Biorad | 4561034 | |
10x Tris/Glycine/SDS | Biorad | 1610772 | |
ANTI-FLAG M2 Affinity Gel | Sigma | A2220 | |
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep | GE Healthcare | NA931-1ML | |
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey | GE Healthcare | NA934-1ML | |
Cell Scraper M | Sumitomo Bakelite | MS-93170 | |
Collagen I Coat Dish 100 mm | IWAKI | 4020-010 | |
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 4693132001 | |
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement | Invitrogen | 10565042 | |
D-PBS (-) | FUJIFILM Wako | 045-29795 | |
Glycerol | FUJIFILM Wako | 072-00626 | |
Glycine | FUJIFILM Wako | 077-00735 | |
HA-Tag (C29F4) Rabbit mAb #3724 | Cell Signaling | C29F4 | |
Laemmli Sample buffer | Bio-Rad Laboratories | 161-0747 | |
Micro Bio-Spin Chromatography Columns | Biorad | 7326204 | |
Mini-PROTEAN Tetra Cell for Mini Precast Gels | Biorad | 1658004JA | |
Monoclonal ANTI-FLAG M2 antibody produced in mouse | Sigma | F3165 | |
NaCl | FUJIFILM Wako | 191-01665 | |
pcDNA3.1-FLAG-PRDM16 | This paper | N/A | |
pcDNA3.1-HA-EHMT1 | This paper | N/A | |
pcDNA3.1-vector | This paper | N/A | |
PEI MAX – Transfection Grade Linear Polyethylenimine Hydrochloride | PSI | 24765 | |
Penicillin-streptomycin solution | FUJIFILM Wako | 168-23191 | |
Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo scientific | 23227 | |
Polyoxyethylene(10) Octylphenyl Ether | FUJIFILM Wako | 168-11805 | |
Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako | 167-11515 | |
Protein G Sepharose 4 Fast Flow Lab Packs | Cytiva | 17061801 | |
Protein LoBind Tubes | eppendorf | 30108442 | |
ROTATOR RT-5 | TAITEC | RT-5 | |
skim milk | Morinaga | 0652842 | |
Stripping Solution | FUJIFILM Wako | 193-16375 | |
Trans-Blot Turbo Mini PVDF Transfer Pack | Biorad | 1704156B03 | |
Trans-Blot Turbo System | Biorad | N/A | |
Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
USDA Tested Fetal Bovine Serum (FBS) | HyClone | SH30910.03 | |
Veriblot | Abcam | ab131366 | |
β-Actin (13E5) Rabbit mAb #4970 | Cell Signaling | 4970S |