Summary

Uso de tintes de bajo costo para visualizar la acumulación de glucógeno y la integridad intestinal en Caenorhabditis elegans

Published: February 23, 2024
doi:

Summary

La enseñanza de las ciencias biológicas puede ser más estimulante para los estudiantes mediante el uso de la experimentación. Este manuscrito presenta dos protocolos diferentes pero complementarios que se pueden utilizar en el aula para alentar a los estudiantes a formular y probar hipótesis relacionadas con las dietas altas en calorías, la inanición y el envejecimiento.

Abstract

Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un nematodo transparente, no parásito y con una biología simple, lo que lo convierte en una gran herramienta para la enseñanza de las ciencias biológicas a través de la tinción de las células o su contenido molecular. El colorante Lugol (solución de yodo-yoduro de potasio) se ha utilizado ampliamente en bioquímica para teñir las reservas de glucógeno. En este contexto, es posible observar diferencias entre los animales alimentados y los hambrientos, además de los efectos de diferentes condiciones, como diferentes dietas y niveles de oxígeno. La erioglaucina es un colorante azul que indica la pérdida de la barrera intestinal. Cuando la barrera intestinal está intacta, el tinte azul se mancha dentro de la luz; Sin embargo, cuando esta integridad se interrumpe, el tinte se filtra en la cavidad corporal. Usando un microscopio estereoscópico o un microscopio, los maestros pueden demostrar alteraciones fisiológicas y bioquímicas, o pueden instigar a los estudiantes a hacer una pregunta científica y formular hipótesis y probar su hipótesis usando estos ensayos. El presente protocolo describe dos técnicas de tinción en C. elegans que pueden ser fácilmente llevadas a cabo por los estudiantes.

Introduction

La enseñanza de las ciencias biológicas en la escuela secundaria es un desafío continuo. Cabe destacar que el acceso y uso de la tecnología ha traído importantes avances en el proceso de enseñanza-aprendizaje, sin embargo, herramientas como los chatbots de inteligencia artificial dificultan la racionalización y la búsqueda de evidencias debido a las respuestas fáciles (y a veces incorrectas) obtenidas1. Por eso, el uso de un método científico con experimentación práctica en un enfoque basado en la indagación en el aula es una estrategia importante para desarrollar o estimular el pensamiento crítico, la creatividad y las habilidades técnicas en los estudiantes2.

En este contexto, el nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans se ha utilizado con éxito en experimentación con fines didácticos3 debido a sus ventajas particulares: no es un parásito y la Escherichia coli utilizada para la alimentación es de nivel de bioseguridad 1, por lo que reduce casi a cero el peligro biológico; tiene un movimiento de locomoción elegante y cuantificable, que es interesante que los estudiantes observen; y es transparente, lo que permite la observación de órganos, pero también la tinción con pigmentos que pueden indicar la presencia de biomoléculas o la ocurrencia de alteraciones fisiológicas4. Por lo tanto, es posible plantear hipótesis y probar en el aula postulados simples relacionados con la bioquímica y los cambios fisiológicos como el envejecimiento.

El glucógeno es un carbohidrato de almacenamiento, formado por una cadena larga y ramificada de moléculas de glucosa formadas por residuos de glucosilo con enlaces lineales glicosídicos (1→4)-α y enlaces glucosídicos (1→6)-α en los puntos de ramificación y es particularmente importante para la contracción muscular, la diferenciación celular y el mantenimiento de la glucemia5. El glucógeno se sintetiza después de la alimentación debido a la activación insulínica de la enzima glucógeno-sintasa. Durante el ejercicio o el ayuno, la epinefrina o el glucagón, respectivamente, activan la glucógeno fosforilasa y, por lo tanto, descomponen el polisacárido para proporcionar glucosa-6-fosfato a las células musculares o liberar glucosa libre para evitar la hipoglucemia 6,7. Las alteraciones en los niveles de glucógeno afectan la diferenciación celular, la señalización, la regulación redox y la madre en diversas condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, incluido el cáncer8. En C. elegans, el glucógeno se encuentra principalmente en el músculo esofágico, la hipodermis, el intestino, las neuronas y principalmente en los músculos de la pared corporal9. El contenido de glucógeno se puede medir utilizando la solución de yodo de Lugol, ya que el yodo se une a las bobinas helicoidales formando un complejo yodo-glucógeno, dando un color azul-negro o marrón-negro visible y agudo, que se ha utilizado con éxito para demostrar el contenido de glucógeno en C. elegans10. Se ha demostrado que la acumulación de glucógeno causada por la alta alimentación con glucosa puede reducir la vida útil de las lombrices, acelerando así el proceso de envejecimiento11,12. Además, las alteraciones metabólicas, otras hormonas y la exposición a xenobióticos pueden alterar el metabolismo del glucógeno13,14. Por lo tanto, la experimentación sobre el contenido de glucógeno en C. elegans es bastante interesante, ya que diversos factores pueden perturbar su metabolismo y pueden estimular una discusión en clase sobre bioquímica básica asociada con temas transversales como el ejercicio, las dietas, las enfermedades y el envejecimiento.

El envejecimiento es un deterioro funcional dependiente del tiempo causado por el daño celular. Este daño puede estar asociado con estrés oxidativo, desgaste de los telómeros, pérdida de proteostasis, inflamación e incluso por acumulación de cuerpos poliglucosanos insolubles15, solo por nombrar algunos. Una de las características del envejecimiento es la reducción de la integridad intestinal, asociada a varias enfermedades crónicas que ocurren durante la vida de un organismo16. El mantenimiento de la homeostasis intestinal depende de la integridad del epitelio intestinal, que está respaldado por proteínas de unión que forman una barrera física y conectan las células epiteliales adyacentes. Cuando hay daño en este epitelio, se produce una fuga de contenido luminal en el intersticio17. Con base en este mecanismo, la prueba del pitufo se ha utilizado para verificar la integridad intestinal en varios modelos animales, ya que este colorante azul sal disódica de erioglaucina no atraviesa la membrana intestinal, permaneciendo en el lumen18. Cuando los gusanos se infectan con un patógeno, se contaminan con algunos tóxicos o envejecen, alterando la integridad intersticial, el tinte cruza la barrera y se extiende por todo el gusano, que se vuelve todo azul. Este ensayo permite discutir sobre la fisiología del envejecimiento y experimentar sobre los factores que pueden acelerar o retrasar este proceso al exponer a los gusanos a diferentes condiciones. Los protocolos aquí describirán en detalle estos dos métodos basados en colorantes que se pueden hacer fácilmente en clase para instigar y estimular a los estudiantes a formular y probar hipótesis relacionadas con la bioquímica y la fisiología.

La primera parte del protocolo muestra su aplicabilidad para analizar cualitativa y cuantitativamente el contenido de glucógeno en el modelo10 de C. elegans. El propósito de la segunda parte del protocolo es evaluar la integridad del intestino de C. elegans. Esta técnica permite el seguimiento del envejecimiento de C. elegans mediante la evaluación de la integridad de las membranas intestinales. Además, permite evaluar si una sustancia acelera o retrasa el envejecimiento y si alguna sustancia tiene potencial tóxico sobre la barrera intestinal19.

La cepa de C. elegans utilizada para el presente estudio fue de tipo silvestre Bristol N2. Sin embargo, el procedimiento puede ser replicado utilizando cepas que exhiban tasas de crecimiento comparables, o el método debe ser ajustado en función de la necesidad de reemplazo de equipos, considerando que tienen la misma o similar función, o dependiendo de la cepa utilizada, ya que ciertas cepas tienen requisitos específicos de mantenimiento y/o sensibilidad; esta información se puede obtener del Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) o del sitio web de WormBase. Estos cambios no deben afectar a la reproducibilidad del método.

Protocol

NOTA: La bacteria Escherichia coli OP50 (E. coli OP50) y las cepas de tipo salvaje Bristol N2 pueden obtenerse del CGC de la Universidad de Minnesota, EE.UU. o de una donación de un laboratorio de C. elegans . Para la seguridad de los investigadores, es imperativo el uso de equipos de protección personal. Aunque las concentraciones de reactivos como el hipoclorito y el hidróxido de sodio son bajas, es esencial usar el EPP recomendado, como se destaca en el manuscrito, para minimizar cualquier riesgo potencial asociado con estos productos químicos. 1. Contenido de glucógeno Preparación de placas de pruebaPrepare seis placas de agar NGMde 60 mm x 15 mm 20 (10 mL de agar de medios de crecimiento de nematodos, NGM, como se describe en la Tabla Suplementaria 1) por cepa de gusano y déjelas secar durante 1 día a temperatura ambiente. Mantenga las placas cerradas para evitar la contaminación. Añadir 200 μL de cultivo líquido de E. coli OP50 (con una densidad óptica = 0,600, aproximadamente a una longitud de onda de 600 nm) por placa para inocular un total de cuatro placas NGM de 60 mm x 15 mm por cepa en la campana de flujo. Deje que las placas cerradas se incuben a 37 °C durante 1 día antes de usarlas.NOTA: Prepare seis placas (paso 1.1) pero inocule solo 4 con la bacteria E. coli OP50. Reserve las dos placas restantes a 4 °C para su uso posterior cuando coloque los gusanos en condiciones de inanición. Este análisis puede realizarse por duplicado. El día de la prueba, agregue 200 μL de D-glucosa 0.025 M a dos placas de agar NGM (6 mm x 15 mm) por cepa que se sembraron previamente con la bacteria E. coli OP50. Deje que las placas se sequen a temperatura ambiente en la campana de flujo.NOTA: Las placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 también se pueden secar cerca de lámparas de alcohol como alternativa al uso de una campana de flujo. SincronizaciónAproximadamente 3 días antes de la sincronización, transfiera 3-4 trozos (3 cm x 3 cm) de un agar NGM de mantenimiento con C. elegans Bristol N2 (tipo silvestre) en diferentes etapas (alrededor de 500 gusanos por trozo) a una nueva placa (150 mm x 90 mm) que haya sido previamente sembrada con la bacteria E. coli OP50. Coloque la nueva placa con lombrices en un ambiente controlado a 20 °C y mantenga la humedad >95% durante 3 días (72 h permiten que la mayoría de las lombrices alcancen la etapa adulta grávida).NOTA: Es posible que sea necesario ajustar la temperatura de crecimiento dependiendo de la(s) cepa(s) de C. elegans que se utilice. Con una pipeta Pasteur, recoja los gusanos de la placa preparada con H2O destilado y transfiéralos a un tubo de centrífuga de 50 mL. Espere la sedimentación de los gusanos por gravedad (aproximadamente 15 min) y luego retire el sobrenadante. Repite este proceso 3 veces para eliminar las bacterias. Después del último lavado, reduzca el volumen a 5 mL. Agregue 10 mL de solución blanqueadora (Tabla suplementaria 1) y agite vigorosamente con las manos durante aproximadamente 6 min. Inmediatamente después de completar la agitación, llene los tubos hasta una capacidad de 50 ml con tampón M9. Centrifugar a 1400 x g durante 3 min, retirar el sobrenadante hasta 5 mL y volver a añadir 45 mL de tampón M9. Repite este proceso 4 veces. Después del último lavado, reduzca el volumen a 15 mL y manténgalo a temperatura (20 °C) y humedad (>95%) controladas durante aproximadamente 14 h.NOTA: El proceso de sincronización puede ser reemplazado por la obtención de óvulos por oviposición: Transfiera aproximadamente 20 gusanos adultos preñados a una placa NGM (6 mm x 15 mm) previamente sembrada con 200 μL de E. coli OP50. Deje que los gusanos pongan huevos durante 1 día. Después de eso, retire los gusanos preñados y espere a que los huevos eclosionen. Preparación de lombricesCon una pipeta automática, añada 10 μL de los gusanos sincronizados (paso 1.2.8) a un portaobjetos de microscopio y cuente el número de gusanos. Calcular cuánto volumen se debe pipetear para obtener 500-1000 gusanos/μL. Transfiera 500-1000 gusanos sincronizados L1 (paso 1.2.8) a placas de agar NGM (150 mm x 90 mm, Tabla Suplementaria 1) sembradas con la bacteria E. coli OP50 como fuente de alimento, hasta que alcancen la etapa larvaria 4 (L4) a 20 °C.NOTA: Los gusanos se pueden transferir mediante una pipeta automática. Si no dispone de una pipeta automática, utilice una pipeta Pasteur de vidrio y los volúmenes se pueden controlar mediante etiquetas de microtubos o pipetas graduadas de vidrio. Después de 48 h de sincronización20: recoja las larvas L4 de las placas con tampón M9 (Tabla suplementaria 1), con la ayuda de una pipeta Pasteur de plástico en un tubo cónico limpio de 50 mL y lávelas 3 veces con tampón M9 fresco o repita los lavados hasta que todas las bacterias E. coli OP50 restantes se eliminen por completo (a temperatura ambiente).NOTA: El paso de lavado es importante porque algunos gusanos experimentarán inanición durante el procedimiento. Ejecución del ensayoTransfiera 500-1000 gusanos L4 (paso 1.3.1) de cada una de las nuevas placas de agar NGM (60 mm x 15 mm) previamente preparadas (pasos 1.1.2 y 1.1.3). Manténgalos a 20 °C durante 48 h hasta el día de la prueba. Este cronograma dará como resultado tres grupos experimentales de la siguiente manera, por duplicado (Figura 1):A- (inanición): los gusanos crecerán en placas de agar NGM regulares sin la bacteria E. coli OP50;B- (regular): los gusanos crecerán en placas de agar NGM regulares sembradas con la bacteria E. coli OP50;C- (glucosa alta): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 y que contienen 0,025 M de D-glucosa. El día de la prueba (después de 48 h): recoger los gusanos y darles tres lavados breves en el tampón M9 (pasos 1.2.2 y 1.2.3)NOTA: Aquí, prepare placas de agar NGM con la adición de D-glucosa (paso 1.3) y déjelas a un lado hasta que sea el momento de agregar los gusanos.Tinción de yodo: prepare una solución de yodo Lugol al 5% (v/v) (solución de yodo/yoduro de potasio) utilizando tampón M9 fresco.NOTA: La solución de yodo de Lugol se puede obtener de proveedores de reactivos o farmacias locales, por lo tanto, la concentración inicial puede variar. Si es necesario, calcule para obtener una solución al 5% (v/v). Transfiera aproximadamente 100 μL de gusanos lavados (paso 4.2) de cada grupo al microtubo de 1,5 mL que contiene solución diluida de Lugol (5% v/v). Con una pipeta automática en una proporción 1:5, transfiera 100 μL de gusanos a 400 μL de solución de Lugol, seguido de una agitación suave en un mezclador durante 5 min.NOTA: Si no se dispone de un mezclador, es posible agitar los microtubos con las manos cuidadosamente. Inmediatamente después de estos 5 minutos, centrifugar el microtubo de 1,5 mL (lombrices + solución de Lugol) a 1400 x g durante 3 minutos.NOTA: Si este ensayo se realiza en gusanos de la etapa L4 o superior, es posible lograr la sedimentación por gravedad en lugar de usar una centrífuga. Deje los microtubos abiertos en rejillas en la mesa de trabajo durante 10 minutos hasta que todos los gusanos se hayan asentado en el fondo del microtubo. Retire el sobrenadante y lave las lombrices con 1,0 mL de tampón M9 fresco. Repita el lavado hasta que se elimine todo el yodo restante de la solución (mínimo 3 veces). Después del último paso de lavado, retire el sobrenadante, excepto un residuo de aproximadamente 100 μL. Utilícelo para volver a suspender suavemente los gusanos y para el análisis microscópico. Transfiera aproximadamente 50 μL de la solución de gusano resuspendida a portaobjetos de microscopía y cúbralos con cubreobjetos. Observe las imágenes de campo claro utilizando un microscopio estereoscópico (a 1,5x).NOTA: Si no se dispone de un microscopio estereoscópico, se puede utilizar un microscopio normal y las imágenes se pueden capturar con la cámara de un teléfono móvil (a 3,4x) utilizando un adaptador. Para evitar errores de luz/brillo/exposición, es crucial que todos los ajustes de la cámara del teléfono móvil sean coherentes para todas las fotografías. Inspección de datosDatos cuantitativos: Calcular el contenido de glucógeno en función de la tinción con yodo de los gusanos.Guarde las imágenes del microscopio estereoscópico que contengan un mínimo de 10 gusanos por grupo como un archivo de .jpeg para su posterior procesamiento. Descargue el software gratuito ImageJ para hacer esto. Los detalles se proporcionan en el Archivo Suplementario 1, Figura Suplementaria 1, Figura Suplementaria 2. Abra la imagen .jpeg con el software ImageJ (que se puede descargar de forma gratuita en https://imagej.nih.gov/ij/download.html). Haga clic en Línea segmentada y delinee el gusano (un gusano a la vez). Haga clic en Analizar y, a continuación, seleccione Medir para obtener la cuantificación de la mancha. Los datos se mostrarán como la media en la tabla. La media indica los datos calculados a partir de la densidad de tinción por área de gusano. Datos cualitativos: Obtener imágenes del microscopio estereoscópico de cada grupo y comparar visualmente la tinción de los gusanos. Cree un sistema de puntuación, si es necesario, para analizar la mancha: 0 incoloro; 1 ligeramente manchado; 2 manchados y 3 muy manchados. Usando el microscopio estereoscópico, cuente manualmente aproximadamente 10 gusanos por grupo (mínimo) con un contador manual. Figura 1: Esquema del ensayo de contenido general de glucógeno en C. elegans. Un esquema del experimento realizado aquí para llevar a cabo el ensayo de contenido de glucógeno. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 2. Evaluación de la permeabilidad intestinal Preparación de lombricesAproximadamente 14 h después de la sincronización (paso 1.2.8), transferir 500-1000 gusanos (paso 1.3.1 y NOTA) en la primera etapa larvaria (L1) a cada nueva placa de agar NGM (60 mm x 15 mm) previamente preparada y mantenerlas a 20 °C hasta el día de la prueba. Este cronograma dará lugar a dos grupos experimentales de la siguiente manera (Figura 2):A- (jóvenes): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 hasta la etapa larvaria 4 (L4);B- (viejo): los gusanos crecerán en placas de agar NGM sembradas con la bacteria E. coli OP50 hasta el7º día de la edad adulta.NOTA: Los gusanos mantenidos hasta el7º día de edad adulta deben lavarse con tampón M9 todos los días y transferirse a nuevas placas de agar NGM (60 mm x 15 mm) con 200 μL de bacteria E. coli OP50 previamente sembradas para reemplazo de alimentos y eliminación de la progenie. Los gusanos más jóvenes flotan durante la decantación y se pueden separar eliminando el sobrenadante. La proporción de gusanos pitufos aumenta con la edad. Sin embargo, la evaluación de la permeabilidad intestinal se puede realizar en cualquier etapa y edad, dependiendo del propósito del estudio. Ejecución del ensayoEl día de la prueba, recoja los gusanos L4 (2 días después del paso 2.1.1) y los gusanos adultos al7º día (ahora en su9º día) con tampón M9 (Tabla suplementaria 1) y transfiéralos a microtubos marcados de 1,5 mL. Centrifugar a 1400 x g durante 3 min, retirar el sobrenadante, añadir 1,0 mL de M9 y mezclar suavemente. Repite este proceso 3 veces para eliminar las bacterias. Después del último lavado, reduzca el volumen a 500 μL. Con una pipeta automática, añada 10 μL del sedimento de lombriz a un portaobjetos de microscopio y cuente el número de lombrices. Calcular el volumen a pipetear para obtener 100 gusanos/μL. Tinción de pitufos: prepare una solución de sal disódica de erioglaucina al 25% (Tabla suplementaria 1) con agua destilada. Si es necesario, utilice el vórtice para una mejor solubilización. En los nuevos microtubos previamente identificados, utilizando una pipeta automática, añadir el volumen que contiene 100 gusanos, 100 μL de solución salina disódica de Erioglaucina al 25%, 200 μL de E. coli OP50 y completar con tampón M9 para un volumen final de 500 μL.NOTA: Los volúmenes de Erioglaucina disódica, E. coli y número de gusanos son fijos. El volumen del tampón M9 es variable y se puede utilizar para llevar el volumen final a 500 μL. Incubar durante 3 h con agitación en una batidora, protegida de la luz, a temperatura ambiente.NOTA: Si no dispone de una batidora, agite cuidadosamente los microtubos con las manos cada 15 minutos. Después de 3 h, centrifugar el microtubo de 1,5 mL a 1400 x g durante 3 min. Retire 1,0 mL de sobrenadante y lave las lombrices con 1,0 mL de tampón M9. Repita los lavados hasta que la solución de sal disódica de erioglaucina restante se elimine de la solución. Después del último paso de lavado, retire el sobrenadante, excepto un residuo de aproximadamente 250 μL. Utilícelo para resuspender cuidadosamente los gusanos y procesarlos para el análisis microscópico. Transfiera aproximadamente 50 lombrices de solución de lombriz resuspendida a portaobjetos de microscopía y cúbralos con cubreobjetos. Incubar los portaobjetos de microscopía en el refrigerador a -20 °C durante 10 min para paralizar las lombrices.NOTA: Otra alternativa para paralizar los gusanos es añadir 10 μL de solución de clorhidrato de Levamisol (10 mM ; Tabla complementaria 1) y cúbralos con cubreobjetos. Observe y cuente el número total de gusanos y los gusanos totalmente teñidos utilizando el campo claro en un microscopio estereoscópico (a 1,5x). Las imágenes se pueden obtener de la cámara de un teléfono celular (a 3.4x) acoplada a un adaptador. Para evitar errores de luz/brillo/exposición, es crucial que todos los ajustes de la cámara del teléfono móvil sean coherentes para todas las fotografías. Inspección de datosDatos cualitativos: Obtener imágenes del microscopio estereoscópico de cada grupo (L4 y7º día de edad adulta) y comparar visualmente la tinción de los gusanos. Cuente el número total de gusanos y el número de gusanos pitufos (gusanos azules) utilizando un microscopio estereoscópico. Expresa los resultados como el porcentaje de gusanos pitufos comparando los gusanos jóvenes (L4, como grupo de control) y los gusanos viejos (7º día de edad adulta):A x X = 100 (%) x BX = 100 x B / ADonde, A = número total de gusanosB= número de gusanos pitufos Figura 2: Esquema del ensayo de permeabilidad intestinal general en C. elegans. (A) Preparación de C. elegans. (B) Tinción con sal disódica de erioglaucina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Representative Results

El ensayo de contenido de glucógeno proporciona un método sólido y rápido para detectar diversas condiciones de prueba, como estudios comparativos de diferentes cepas que pueden influir en la síntesis o degradación de glucógeno. En este estudio, los gusanos L4 se sometieron a tres condiciones de prueba distintas: grupos en ayunas, alimentación y enriquecidos con glucosa. El ensayo se realizó tres veces, y cada condición se replicó dos veces en cada ensayo; en la <strong class=…

Discussion

En resumen, este protocolo proporciona una evaluación cualitativa del contenido de glucógeno en gusanos C. elegans individuales mediante la tinción de Lugol: un ensayo sencillo, robusto y rápido. La tinción de Lugol es un enfoque no invasivo y sin marcadores que facilita la adquisición de datos moleculares a resoluciones subcelulares, lo que permite el seguimiento de las fluctuaciones del contenido de glucógeno dentro de gusanos individuales10. Ade…

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.S.A reconoce el financiamiento del Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brasil), subvención número #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brasil), subvención número, 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código de Finanzas 001 para N.S.J y A.C.S)

Materials

1.5 mL microtubes  Local suppliers
37-degree incubator KS 4000i  97014-816
50 mL conical tube Local suppliers
6 cm Petri plates  Local suppliers
Agar bacteriological Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 9002-18-0
C. elegans Bristol N2 (wild type) Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)
CaCL2 Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 10035-04-8
Cholesterol Sigma-Aldrich Brasil Ltda 57-88-5
D-(+)-Glucose anhydrous  Neon 50-99-7
Distilled H2O Local suppliers
Erioglaucine disodium salt Sigma-Aldrich Brasil Ltda 3844-45-9
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA)
Flow hood Mylabor
Incubator Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA.
KH2PO4 Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 7778-77-0
Levamisole hydrochloride RIPERCOL L 150F
Lugol solution Sigma-Aldrich Brasil Ltda L6146
MgSO4 Synth S1063-01-AH
Microcentrifuge Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany
Na2HPO4 Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 7558-79-4
NaCl Dinâmica Química Contemporânea Ltda. 7647-14-5
Nystatin Sigma-Aldrich Brasil Ltda N6261
Peptone bacteriological êxodo científica 91079-38-8
Stereomicroscope Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil)
Streptomycin Sulfate Estreptomax

Referencias

  1. Thorp, H. H. ChatGPT is fun, but not an author. Science. 379 (6630), 313 (2023).
  2. Lemons, M. L. An inquiry-based approach to study the synapse: Student-driven experiments using C. elegans. J Undergrad Neurosci Educ. 15 (1), A44-A55 (2016).
  3. Andersen, J., Krichevsky, A., Leheste, J. R., Moloney, D. J. Caenorhabditis elegans as an undergraduate educational tool for teaching RNAi. Biochem Mol Biol Educ. 36 (6), 417-427 (2008).
  4. Martins, R. R., McCracken, A. W., Simons, M. J. P., Henriques, C. M., Rera, M. How to catch a smurf? – Ageing and beyond… In vivo assessment of intestinal permeability in multiple model organisms. Bio Protoc. 8 (3), e2722 (2018).
  5. Ellingwood, S. S., Cheng, A. Biochemical and clinical aspects of glycogen storage diseases. J Endocrinol. 238 (3), R131-R141 (2018).
  6. Cori, C. F., Cori, G. T. Glycogen formation in the liver from d-and l-lactic acid. J Bio Chem. 81 (2), 389-403 (1929).
  7. Wosilait, W. D., Sutherland, E. W. The relationship of epinephrine and glucagon to liver phosphorylase. II. Enzymatic inactivation of liver phosphorylase. J Biol Chem. 218 (1), 469-481 (1956).
  8. Zhang, H., Ma, J., Tang, K., Huang, B. Beyond energy storage: roles of glycogen metabolism in health and disease. FEBS J. 288 (12), 3772-3783 (2021).
  9. Liu, Q., et al. Characterization of glycogen molecular structure in the worm Caenorhabditis elegans. Carbohydr Polym. 237, 116181 (2020).
  10. Cherkas, A., et al. Label-free molecular mapping and assessment of glycogen in C. elegans.Analyst. 144 (7), 2367-2374 (2019).
  11. Gusarov, I., et al. Glycogen controls Caenorhabditis elegans lifespan and resistance to oxidative stress. Nat Commun. 8, 15868 (2017).
  12. Seo, Y., Kingsley, S., Walker, G., Mondoux, M. A., Tissenbaum, H. A. Metabolic shift from glycogen to trehalose promotes lifespan and healthspan in Caenorhabditis elegans. Proc Natl Acad Sci U S A. 115 (12), E2791-E2800 (2018).
  13. Frazier, H. N., Roth, M. B. Adaptive sugar provisioning controls survival of C. elegans embryos in adverse environments. Curr Biol. 19 (10), 859-863 (2009).
  14. da Silva, F. N., Zimath, P. L., do Amaral, T. A., Martins, J. R. N., Rafacho, A. Coadministration of olanzapine causes minor impacts on the diabetogenic outcomes induced by dexamethasone treatment in rats. Life Sci. 322, 121660 (2023).
  15. Gusarov, I., Nudler, E. Glycogen at the crossroad of stress resistance, energy maintenance, and pathophysiology of aging. Bioessays. 40 (9), e1800033 (2018).
  16. Untersmayr, E., Brandt, A., Koidl, L., Bergheim, I. The intestinal barrier dysfunction as driving factor of inflammaging. Nutrients. 14 (5), 949 (2022).
  17. Lin, P. Y., Stern, A., Peng, H. H., Chen, J. H., Yang, H. C. Redox and metabolic regulation of intestinal barrier function and associated disorders. Int J Mol Sci. 23 (22), 14463 (2022).
  18. Dambroise, E., et al. Two phases of aging separated by the Smurf transition as a public path to death. Sci Rep. 6, 23523 (2016).
  19. Laranjeiro, R., et al. Swim exercise in Caenorhabditis elegans extends neuromuscular and gut healthspan, enhances learning ability, and protects against neurodegeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (47), 23829-23839 (2019).
  20. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans.WormBook. , 1-11 (2006).
  21. McGhee, J. D. The C. elegans intestine. WormBook: The Online Review of C. elegans Biology. , (2007).
  22. McGee, M. D., et al. Loss of intestinal nuclei and intestinal integrity in aging C. elegans. Aging Cell. 10 (4), 699-710 (2011).
  23. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS genetics. 12 (7), e1006135 (2016).
  24. Rera, M., Clark, R. I., Walker, D. W. Intestinal barrier dysfunction links metabolic and inflammatory markers of aging to death in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (52), 21528-21533 (2012).
  25. Zhang, G., Gu, Y., Dai, X. Protective effect of bilberry anthocyanin extracts on dextran sulfate sodium-induced intestinal damage in Drosophila melanogaster. Nutrients. 14 (14), 2875 (2022).
  26. Gelino, S., et al. Intestinal autophagy improves healthspan and longevity in C. elegans during dietary restriction. PLoS Genet. 12 (7), e1006135 (2016).
  27. Qu, M., Xu, K., Li, Y., Wong, G., Wang, D. Using acs-22 mutant Caenorhabditis elegans to detect the toxicity of nanopolystyrene particles. Sci Total Environ. 643, 119-126 (2018).

Play Video

Citar este artículo
Jardim, N. S., Silva, A. C., Avila, D. S. Using Low-Cost Dyes to Visualize Glycogen Accumulation and Gut Integrity in Caenorhabditis elegans . J. Vis. Exp. (204), e66084, doi:10.3791/66084 (2024).

View Video