La enseñanza de las ciencias biológicas puede ser más estimulante para los estudiantes mediante el uso de la experimentación. Este manuscrito presenta dos protocolos diferentes pero complementarios que se pueden utilizar en el aula para alentar a los estudiantes a formular y probar hipótesis relacionadas con las dietas altas en calorías, la inanición y el envejecimiento.
Caenorhabditis elegans (C. elegans) es un nematodo transparente, no parásito y con una biología simple, lo que lo convierte en una gran herramienta para la enseñanza de las ciencias biológicas a través de la tinción de las células o su contenido molecular. El colorante Lugol (solución de yodo-yoduro de potasio) se ha utilizado ampliamente en bioquímica para teñir las reservas de glucógeno. En este contexto, es posible observar diferencias entre los animales alimentados y los hambrientos, además de los efectos de diferentes condiciones, como diferentes dietas y niveles de oxígeno. La erioglaucina es un colorante azul que indica la pérdida de la barrera intestinal. Cuando la barrera intestinal está intacta, el tinte azul se mancha dentro de la luz; Sin embargo, cuando esta integridad se interrumpe, el tinte se filtra en la cavidad corporal. Usando un microscopio estereoscópico o un microscopio, los maestros pueden demostrar alteraciones fisiológicas y bioquímicas, o pueden instigar a los estudiantes a hacer una pregunta científica y formular hipótesis y probar su hipótesis usando estos ensayos. El presente protocolo describe dos técnicas de tinción en C. elegans que pueden ser fácilmente llevadas a cabo por los estudiantes.
La enseñanza de las ciencias biológicas en la escuela secundaria es un desafío continuo. Cabe destacar que el acceso y uso de la tecnología ha traído importantes avances en el proceso de enseñanza-aprendizaje, sin embargo, herramientas como los chatbots de inteligencia artificial dificultan la racionalización y la búsqueda de evidencias debido a las respuestas fáciles (y a veces incorrectas) obtenidas1. Por eso, el uso de un método científico con experimentación práctica en un enfoque basado en la indagación en el aula es una estrategia importante para desarrollar o estimular el pensamiento crítico, la creatividad y las habilidades técnicas en los estudiantes2.
En este contexto, el nematodo de vida libre Caenorhabditis elegans se ha utilizado con éxito en experimentación con fines didácticos3 debido a sus ventajas particulares: no es un parásito y la Escherichia coli utilizada para la alimentación es de nivel de bioseguridad 1, por lo que reduce casi a cero el peligro biológico; tiene un movimiento de locomoción elegante y cuantificable, que es interesante que los estudiantes observen; y es transparente, lo que permite la observación de órganos, pero también la tinción con pigmentos que pueden indicar la presencia de biomoléculas o la ocurrencia de alteraciones fisiológicas4. Por lo tanto, es posible plantear hipótesis y probar en el aula postulados simples relacionados con la bioquímica y los cambios fisiológicos como el envejecimiento.
El glucógeno es un carbohidrato de almacenamiento, formado por una cadena larga y ramificada de moléculas de glucosa formadas por residuos de glucosilo con enlaces lineales glicosídicos (1→4)-α y enlaces glucosídicos (1→6)-α en los puntos de ramificación y es particularmente importante para la contracción muscular, la diferenciación celular y el mantenimiento de la glucemia5. El glucógeno se sintetiza después de la alimentación debido a la activación insulínica de la enzima glucógeno-sintasa. Durante el ejercicio o el ayuno, la epinefrina o el glucagón, respectivamente, activan la glucógeno fosforilasa y, por lo tanto, descomponen el polisacárido para proporcionar glucosa-6-fosfato a las células musculares o liberar glucosa libre para evitar la hipoglucemia 6,7. Las alteraciones en los niveles de glucógeno afectan la diferenciación celular, la señalización, la regulación redox y la madre en diversas condiciones fisiológicas y fisiopatológicas, incluido el cáncer8. En C. elegans, el glucógeno se encuentra principalmente en el músculo esofágico, la hipodermis, el intestino, las neuronas y principalmente en los músculos de la pared corporal9. El contenido de glucógeno se puede medir utilizando la solución de yodo de Lugol, ya que el yodo se une a las bobinas helicoidales formando un complejo yodo-glucógeno, dando un color azul-negro o marrón-negro visible y agudo, que se ha utilizado con éxito para demostrar el contenido de glucógeno en C. elegans10. Se ha demostrado que la acumulación de glucógeno causada por la alta alimentación con glucosa puede reducir la vida útil de las lombrices, acelerando así el proceso de envejecimiento11,12. Además, las alteraciones metabólicas, otras hormonas y la exposición a xenobióticos pueden alterar el metabolismo del glucógeno13,14. Por lo tanto, la experimentación sobre el contenido de glucógeno en C. elegans es bastante interesante, ya que diversos factores pueden perturbar su metabolismo y pueden estimular una discusión en clase sobre bioquímica básica asociada con temas transversales como el ejercicio, las dietas, las enfermedades y el envejecimiento.
El envejecimiento es un deterioro funcional dependiente del tiempo causado por el daño celular. Este daño puede estar asociado con estrés oxidativo, desgaste de los telómeros, pérdida de proteostasis, inflamación e incluso por acumulación de cuerpos poliglucosanos insolubles15, solo por nombrar algunos. Una de las características del envejecimiento es la reducción de la integridad intestinal, asociada a varias enfermedades crónicas que ocurren durante la vida de un organismo16. El mantenimiento de la homeostasis intestinal depende de la integridad del epitelio intestinal, que está respaldado por proteínas de unión que forman una barrera física y conectan las células epiteliales adyacentes. Cuando hay daño en este epitelio, se produce una fuga de contenido luminal en el intersticio17. Con base en este mecanismo, la prueba del pitufo se ha utilizado para verificar la integridad intestinal en varios modelos animales, ya que este colorante azul sal disódica de erioglaucina no atraviesa la membrana intestinal, permaneciendo en el lumen18. Cuando los gusanos se infectan con un patógeno, se contaminan con algunos tóxicos o envejecen, alterando la integridad intersticial, el tinte cruza la barrera y se extiende por todo el gusano, que se vuelve todo azul. Este ensayo permite discutir sobre la fisiología del envejecimiento y experimentar sobre los factores que pueden acelerar o retrasar este proceso al exponer a los gusanos a diferentes condiciones. Los protocolos aquí describirán en detalle estos dos métodos basados en colorantes que se pueden hacer fácilmente en clase para instigar y estimular a los estudiantes a formular y probar hipótesis relacionadas con la bioquímica y la fisiología.
La primera parte del protocolo muestra su aplicabilidad para analizar cualitativa y cuantitativamente el contenido de glucógeno en el modelo10 de C. elegans. El propósito de la segunda parte del protocolo es evaluar la integridad del intestino de C. elegans. Esta técnica permite el seguimiento del envejecimiento de C. elegans mediante la evaluación de la integridad de las membranas intestinales. Además, permite evaluar si una sustancia acelera o retrasa el envejecimiento y si alguna sustancia tiene potencial tóxico sobre la barrera intestinal19.
La cepa de C. elegans utilizada para el presente estudio fue de tipo silvestre Bristol N2. Sin embargo, el procedimiento puede ser replicado utilizando cepas que exhiban tasas de crecimiento comparables, o el método debe ser ajustado en función de la necesidad de reemplazo de equipos, considerando que tienen la misma o similar función, o dependiendo de la cepa utilizada, ya que ciertas cepas tienen requisitos específicos de mantenimiento y/o sensibilidad; esta información se puede obtener del Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC) o del sitio web de WormBase. Estos cambios no deben afectar a la reproducibilidad del método.
En resumen, este protocolo proporciona una evaluación cualitativa del contenido de glucógeno en gusanos C. elegans individuales mediante la tinción de Lugol: un ensayo sencillo, robusto y rápido. La tinción de Lugol es un enfoque no invasivo y sin marcadores que facilita la adquisición de datos moleculares a resoluciones subcelulares, lo que permite el seguimiento de las fluctuaciones del contenido de glucógeno dentro de gusanos individuales10. Ade…
The authors have nothing to disclose.
D.S.A reconoce el financiamiento del Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento (CNPq/Brasil), subvención número #301808/2018-0, #313117/2019-5, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS/Brasil), subvención número, 21/2551-0001963-8, Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES, Código de Finanzas 001 para N.S.J y A.C.S)
1.5 mL microtubes | Local suppliers | – | |
37-degree incubator | KS 4000i | 97014-816 | |
50 mL conical tube | Local suppliers | – | |
6 cm Petri plates | Local suppliers | – | |
Agar bacteriological | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 9002-18-0 | |
C. elegans Bristol N2 (wild type) | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | – | |
CaCL2 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 10035-04-8 | |
Cholesterol | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 57-88-5 | |
D-(+)-Glucose anhydrous | Neon | 50-99-7 | |
Distilled H2O | Local suppliers | – | |
Erioglaucine disodium salt | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | 3844-45-9 | |
Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis elegans Genetic Center (CGC, Minnesota, USA) | – | |
Flow hood | Mylabor | ||
Incubator | Panasonic Healthcare company of North America, MIR-254-PA. | – | |
KH2PO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7778-77-0 | |
Levamisole hydrochloride | RIPERCOL L 150F | – | |
Lugol solution | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | L6146 | |
MgSO4 | Synth | S1063-01-AH | |
Microcentrifuge | Centrifuge 5425R Eppendorf SE, Germany | ||
Na2HPO4 | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7558-79-4 | |
NaCl | Dinâmica Química Contemporânea Ltda. | 7647-14-5 | |
Nystatin | Sigma-Aldrich Brasil Ltda | N6261 | |
Peptone bacteriological | êxodo científica | 91079-38-8 | |
Stereomicroscope | Leica S8 Apo Stereomicroscope (São Paulo, Brazil) | ||
Streptomycin Sulfate | Estreptomax | – |