Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents
Summary
Ce protocole décrit le marquage et l’injection par fluorescence personnalisés à base d’anticorps dans les embryons précoces de drosophile pour permettre l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou de modifications post-traductionnelles difficiles à détecter à l’aide des approches traditionnelles GFP/mCherry-tag.
Abstract
La visualisation des protéines dans les cellules vivantes à l’aide de la GFP (Green Fluorescent Protein) et d’autres marqueurs fluorescents a considérablement amélioré la compréhension de la localisation, de la dynamique et de la fonction des protéines. Par rapport à l’immunofluorescence, l’imagerie en direct reflète plus précisément la localisation des protéines sans artefacts potentiels résultant de la fixation tissulaire. Il est important de noter que l’imagerie en direct permet une caractérisation quantitative et temporelle des niveaux et de la localisation des protéines, ce qui est crucial pour comprendre les processus biologiques dynamiques tels que le mouvement ou la division cellulaire. Cependant, une limitation majeure des approches de marquage fluorescent est la nécessité d’avoir des niveaux d’expression protéique suffisamment élevés pour obtenir une visualisation réussie. Par conséquent, de nombreuses protéines fluorescentes marquées de manière endogène avec des niveaux d’expression relativement faibles ne peuvent pas être détectées. D’autre part, l’expression ectopique à l’aide de promoteurs viraux peut parfois conduire à une mauvaise localisation des protéines ou à des altérations fonctionnelles dans des contextes physiologiques. Pour remédier à ces limitations, une approche est présentée qui utilise la détection de protéines médiées par des anticorps hautement sensibles dans des embryons vivants, effectuant essentiellement une immunofluorescence sans avoir besoin de fixation tissulaire. Comme preuve de principe, le récepteur Notch marqué à la GFP de manière endogène, qui est à peine détectable dans les embryons vivants, peut être visualisé avec succès après l’injection d’anticorps. De plus, cette approche a été adaptée pour visualiser les modifications post-traductionnelles (PTM) dans les embryons vivants, permettant de détecter les changements temporels dans les schémas de phosphorylation de la tyrosine au cours de l’embryogenèse précoce et révélant une nouvelle sous-population de phosphotyrosine (p-Tyr) sous les membranes apicales. Cette approche peut être modifiée pour s’adapter à d’autres anticorps spécifiques à une protéine, à un marqueur ou à un PTM et devrait être compatible avec d’autres organismes modèles ou lignées cellulaires susceptibles d’être injectés. Ce protocole ouvre de nouvelles possibilités pour l’imagerie en direct de protéines de faible abondance ou PTM qui étaient auparavant difficiles à détecter à l’aide des méthodes traditionnelles de marquage par fluorescence.
Introduction
L’immunofluorescence est une technique fondamentale de la biologie cellulaire moderne développée à l’origine par Albert Coons, qui permet de détecter des molécules dans leurs compartiments cellulaires natifs et de caractériser les compositions moléculaires d’organites ou de machineries subcellulaires1. Couplée à des manipulations génétiques, l’immunofluorescence permet d’établir le concept désormais bien accepté selon lequel la localisation des protéines est essentielle à leur fonction2. Outre les anticorps primaires spécifiques et les colorants fluorescents brillants, le succès de cette technique repose sur un processus préliminaire appelé fixation et perméabilisation, qui préserve les morphologies cellulaires, immobilise les antigènes et augmente l’accessibilité des anticorps dans les compartiments intracellulaires. Inévitablement, le processus de fixation et de perméabilisation tuerait les cellules et mettrait fin à tous les processus biologiques3. Par conséquent, l’immunofluorescence ne fournit que des instantanés du parcours de vie des protéines. Cependant, de nombreux processus biologiques tels que la migration et les divisions cellulaires sont de nature dynamique, ce qui nécessite l’étude des comportements des protéines d’une manière spatio-temporellement résolue 4,5.
Pour étudier la dynamique des protéines dans les organismes vivants, des méthodes d’imagerie en direct basées sur des protéines fluorescentes génétiquement codées telles que la protéine fluorescente verte (GFP)6 et des microscopes confocaux à grande vitesse ont été développées. En bref, la protéine d’intérêt peut être manipulée génétiquement pour être fusionnée avec la GFP7, puis exprimée de manière ectopique à partir de promoteurs viraux ou de levure tels que le cytomégalovirus (CMV)8 ou la séquence d’activation en amont (UAS)9. Étant donné que la GFP est de nature autofluorescente, aucun anticorps couplé à des fluorophores n’est nécessaire pour révéler la localisation des protéines cibles, ce qui contourne la nécessité de processus préliminaires de fixation ou de perméabilisation. Au cours des deux dernières décennies, des marqueurs fluorescents couvrant l’ensemble du spectre des longueurs d’onde ont étédéveloppés10, permettant l’imagerie en direct multicolore de plusieurs protéines cibles en même temps. Cependant, par rapport aux colorants fluorescents chimiquement modifiés tels que AlexaFluor ou ATTO, l’autofluorescence de ces protéines fluorescentes génétiquement codées est relativement faible et instable lorsqu’elle est exprimée à partir de promoteurs endogènes, en particulier lors de l’imagerie en direct sur des échelles de temps plus longues10. Bien que ce déficit puisse être atténué par une surexpression des protéines cibles marquées par fluorescence, beaucoup d’entre elles ayant des activités enzymatiques telles que les kinases et les phosphatases perturbent gravement les processus biologiques normaux si elles ne sont pas exprimées à des niveaux physiologiques.
Ce protocole présente une méthode qui permet l’illumination de la cible photostable à base d’anticorps dans une configuration d’image en direct, permettant essentiellement l’immunofluorescence sans processus de fixation ou de perméabilisation (Figure 1). Grâce à une simple réaction d’amine primaire basée sur le NHS11, on peut conjuguer des colorants fluorescents tels que AlexaFluor 488 ou 594 avec essentiellement n’importe quel anticorps primaire ou GFP/HA/Myc nanobody12. En tirant parti d’une caractéristique de développement selon laquelle toutes les cellules embryonnaires de la drosophile partagent un cytoplasme commun au stade13 du syncytium, il est possible d’obtenir une liaison à l’antigène et une illumination sur des embryons entiers après l’injection d’anticorps conjugués à un colorant. Avec l’expansion des bibliothèques de protéines marquées de manière endogène disponibles chez la drosophile et d’autres systèmes modèles14, cette méthode peut potentiellement élargir les applications de ces bibliothèques en révélant la dynamique des protéines marquées par fluorescence de faible abondance et d’autres protéines non marquées par fluorescence (marquées HA/Myc) dans les tissus vivants.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette procédure présente la méthode spécialisée de marquage par fluorescence avec des anticorps personnalisés et l’injection subséquente dans des embryons de drosophile à un stade précoce. Cette technique facilite la visualisation en temps réel des protéines ou des modifications post-traductionnelles qui existent en faibles quantités et qui sont généralement difficiles à observer par les méthodes conventionnelles de marquage GFP/mCherry.
Il faut faire preuve de prude…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier la Dre Jennifer A. Zallen d’avoir fourni la lignée de drosophile Sqh-GFP et son soutien pour le développement initial de cette technique, ainsi que le Dr François Schweisguth d’avoir fourni la lignée de drosophile Notch-GFP. Ce travail a été soutenu par un financement de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32270809) à H.H.Yu, un généreux soutien financier et personnel de l’École des sciences de la vie, SUSTech, et un financement à Y. Yan de la Commission de l’innovation scientifique et technologique de Shenzhen/JCYJ20200109140201722.
Materials
| Agarose | Sangon Biotech | A620014 | |
| Alexa Fluor 594 Antibody Labeling Kit | Invitrogen | A20185 | Purification column from step 1.6 is included in this kit |
| Biological Microscope | SOPTOP | EX20 | Eyepiece lens: PL 10X/20. Objective lens: 10x/0.25 |
| Bleach | Clorox® | ||
| Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5245 | |
| Cell Strainer | FALCON | 352350 | |
| Desiccation chamber | LOCK&LOCK | HSM8200 | 320ml |
| Dissecting Microscope | Mshot | MZ62 | Eyepiece lens: WF10X/22mm. |
| Double-sided Tape | Scotch | 665 | |
| Fine Super Tweezer | VETUS | ST-14 | |
| Fisherbrand™ Cover Glasses: Rectangles | Fisherbrand | 12-545F | |
| Fisherbrand™ Superfrost™ Plus Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| Forcep | VETUS | 33A-SA | |
| Halocarbon oil 27 | Sigma-Aldrich | H8773-100ML | |
| Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
| Heptane | Sigma-Aldrich | H2198-1L | Heptane glue is made of double-sided tape immersed in heptane |
| Dehydration reagent | TOKAI | 1-7315-01 | Fill to 90% volume of the dessication chamber |
| Manual Micromanipulator | World Precision Instruments | M3301R | |
| Micropipette puller | World Precision Instruments | PUL-1000 | Procedure: step 1, Heat: 290, Force:300, Distance:1.00, Delay:50. Step 2, Heat: 290, Force:300, Distance:2.21, Delay:50 |
| Pneumatic picopump | World Precision Instruments | PV 830 | Eject: 20 psi; Range: 100ms; Duration: timed |
| PY20 | Santa Cruz | SC-508 | |
| Square petri dishes | Biosharp | BS-100-SD | |
| GFP nanobody | Chromotek | gt |
Referencias
- Coons, A. H. The beginnings of immunofluorescence. Journal of Immunology (Baltimore, Md). 87, 499-503 (1961).
- Arthur, G., et al. Harnessing the power of the antibody. The Lancet Respiratory Medicine. 4 (3), 181-182 (2016).
- Im, K., Mareninov, S., Diaz, M. F. P., Yong, W. H. Biobanking, methods and protocols. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2018).
- Ragkousi, K., Gibson, M. C. Epithelial integrity and cell division: Concerted cell cycle control. Cell Cycle. 17 (4), 399-400 (2018).
- Herszterg, S., Leibfried, A., Bosveld, F., Martin, C., Bellaiche, Y. Interplay between the dividing cell and its neighbors regulates adherens junction formation during cytokinesis in epithelial tissue. Developmental Cell. 24 (3), 256-270 (2013).
- Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, aequorea. Journal of Cellular and Comparative Physiology. 59 (3), 223-239 (1962).
- Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. Green fluorescent protein as a marker for gene expression. Science. 263 (5148), 802-805 (1994).
- Boshart, M., et al. A very strong enhancer is located upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus. Cell. 41 (2), 521-530 (1985).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), 401-415 (1993).
- Rodriguez, E. A., et al. The growing and glowing toolbox of fluorescent and photoactive proteins. Trends in Biochemical Sciences. 42 (2), 111-129 (2016).
- Berg, E. A., Fishman, J. B. Labeling antibodies using N -Hydroxysuccinimide (NHS)-fluorescein. Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (3), (2019).
- Saerens, D., et al. Identification of a universal VHH framework to graft non-canonical antigen-binding loops of camel single-domain antibodies. Journal of Molecular Biology. 352 (3), 597-607 (2005).
- Loncar, D., Singer, S. J. Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (6), 2199-2203 (1995).
- Lye, C. M., Naylor, H. W., Sanson, B. Subcellular localisations of the CPTI collection of YFP-tagged proteins in Drosophila embryos. Development. 141 (20), 4006-4017 (2014).
- Iordanou, E., Chandran, R. R., Blackstone, N., Jiang, L. RNAi interference by dsRNA injection into Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 50, e2477 (2011).
- Figard, L., Sokac, A. M. Imaging cell shape change in living Drosophila embryos. Journal of Visualized Experiments. 49, e2503 (2011).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , 9-102 (1997).
- Ho, D. M., Artavanis-Tsakonas, S. The Notch-mediated proliferation circuitry. Current Topics in Developmental Biology. 116, 17-33 (2016).
- Kopan, R., Ilagan, X. G., Ma, The canonical Notch signaling pathway: unfolding the activation mechanism. Cell. 137 (2), 216-233 (2009).
- Fehon, R. G., et al. Molecular interactions between the protein products of the neurogenic loci Notch and Delta, two EGF-homologous genes in Drosophila. Cell. 61 (3), 523-534 (1990).
- Struhl, G., Greenwald, I. Presenilin is required for activity and nuclear access of Notch in Drosophila. Nature. 398 (6727), 522-525 (1999).
- Henrique, D., Schweisguth, F. Mechanisms of Notch signaling: a simple logic deployed in time and space. Development. 146 (3), dev172148 (2019).
- Trylinski, M., Mazouni, K., Schweisguth, F. Intra-lineage fate decisions involve of notch receptors basal to the midbody in drosophila sensory organ precursor cells. Current Biology. 27 (15), 2239.e3-2247.e3 (2017).
- Hunter, T. Protein kinases and phosphatases: The Yin and Yang of protein phosphorylation and signaling. Cell. 80 (2), 225-236 (1995).
- Glenney, J. R., Zokas, L., Kamps, M. P. Monoclonal antibodies to phosphotyrosine. Journal of Immunological Methods. 109 (2), 277-285 (1988).
- Hunter, T., Cooper, J. A. Epidermal growth factor induces rapid tyrosine phosphorylation of proteins in A431 human tumor cells. Cell. 24 (3), 741-752 (1981).
- Yu, H. H., Zallen, J. A. Abl and Canoe/Afadin mediate mechanotransduction at tricellular junctions. Science. 370 (6520), eaba5528 (2020).
- Martin, A. C., Kaschube, M., Wieschaus, E. F. Pulsed contractions of an actin–myosin network drive apical constriction. Nature. 457 (7228), 495-499 (2009).
