Real-time High Throughput Technique for å kvantifisere dannelse av nøytrofile ekstracellulære feller i humane nøytrofiler
Summary
Vi presenterer en automatisert metode med høy gjennomstrømning for å kvantifisere nøytrofile ekstracellulære feller (NET) ved hjelp av analysesystemet for levende celler, kombinert med en membranpermeabilitetsavhengig dual-dye-tilnærming.
Abstract
Neutrofiler er myeloide avstamningsceller som danner en viktig del av det medfødte immunsystemet. Det siste tiåret har avslørt flere nøkkelroller som nøytrofiler spiller i patogenesen av kreft, autoimmune sykdommer og ulike akutte og kroniske inflammatoriske tilstander ved å bidra til initiering og videreføring av immundysregulering gjennom flere mekanismer, inkludert dannelsen av nøytrofile ekstracellulære feller (NET), som er strukturer som er avgjørende for antimikrobielt forsvar. Begrensninger i teknikker for å kvantifisere NET-dannelse på en objektiv, reproduserbar og effektiv måte har begrenset vår evne til å forstå nøytrofilenes rolle i helse og sykdommer. Vi beskriver en automatisert, sanntids, høy gjennomstrømningsmetode for å kvantifisere nøytrofiler som gjennomgår NET-dannelse ved hjelp av en levende cellebildeplattform kombinert med en membranpermeabilitetsavhengig dual-dye-tilnærming ved hjelp av to forskjellige DNA-fargestoffer for å avbilde intracellulært og ekstracellulært DNA. Denne metoden er i stand til å bidra til å vurdere nøytrofil fysiologi og teste molekyler som kan målrette NET-dannelse.
Introduction
Neutrofile ekstracellulære feller (NET) er nettlignende kromatinstrukturer ekstrudert fra nøytrofiler som respons på ulike inflammatoriske stimuli. NET er sammensatt av DNA, histoner og forskjellige antimikrobielle proteiner / peptider, som fanger og dreper smittsomme patogener og påkaller inflammatoriske responser1.
Mens NET er gunstig for vertsforsvar mot patogener, har de samlet oppmerksomhet som en potensiell driver for ulike autoimmune sykdommer2, trombose3, metabolske sykdommer4 og metastatisk vekst av kreft5. Som sådan er inhibering av NET-dannelse et potensielt terapeutisk alternativ for disse sykdommene. Til tross for noen lovende NET-målrettede molekyler i utvikling6, er det imidlertid fortsatt ingen godkjent terapi som spesifikt påvirker denne mekanismen. Dette er, i det minste delvis, på grunn av mangelen på objektive, objektive, reproduserbare og kvantifiseringsmetoder med høy gjennomstrømning for NET-dannelse.
Vi etablerte og rapporterte en ny metode ved hjelp av en dual-color live-cell imaging plattform 7,8. Time-lapse-bilder av nøytrofiler farget med membranpermeabelt kjernefysisk fargestoff og membran-ugjennomtrengelig DNA-fargestoff analyseres av programvaren, og antall pre- og post-NET-dannende nøytrofiler telles på flere tidspunkter. Siden integriteten til plasmamembranen går tapt under NET-dannelse ved regulering av PKCα-mediert Lamin B og CDK4/6-mediert Lamin A/C-demontering9, blir NET-dannende nøytrofiler farget av membranugjennomtrengelig DNA-fargestoff mens friske nøytrofiler ikke er det. Denne metoden overvinner problemene med tidligere rapporterte teknikker for å kvantifisere NET-dannelse og gir objektiv, høy gjennomstrømning, reproduserbar og nøyaktig NET-kvantifisering på en automatisert måte.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nåværende metoder for å kvantifisere NET ex vivo har flere ulemper som begrenser vår evne til å studere nøytrofiler, NET og potensielle terapeutiske mål på en objektiv og høy gjennomstrømningsmåte10,14. For eksempel er direkte telling av NET-dannende celler etter immunfluorescerende farging, betraktet som gullstandarden for kvantifisering av NET, lav gjennomstrømning og avhengig av operatørens subjektive syn. En plateanalyse som påviser flu…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Light Imaging Section i Office of Science and Technology ved Nasjonalt institutt for leddgikt og muskuloskeletale og hudsykdommer i National Institutes of Health. Denne forskningen ble støttet av det intramurale forskningsprogrammet fra Nasjonalt institutt for leddgikt og muskuloskeletale og hudsykdommer ved National Institutes of Health (ZIA AR041199).
Materials
| AKT inhibitor | Calbiochem | 124028 | |
| Clear 96-well plate | Corning | 3596 | |
| Live cell analysis system | Sartorius | N/A | Incucyte Software (v2019B) |
| Membrane-impermeable DNA green dye | Thermo Fisher Scientific | S7020 | |
| Nuclear red dye | Enzo | ENZ-52406 | Neutrophil pellet becomes bluish after staining. |
| RPMI | Thermo Fisher Scientific | 11835030 | Phenol red containig RPMI can be used. |
Referencias
- Brinkmann, V., et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria. Science. 303 (5663), 1532-1535 (2004).
- Wigerblad, G., Kaplan, M. J. Neutrophil extracellular traps in systemic autoimmune and autoinflammatory diseases. Nat Rev Immunol. 23 (5), 274-288 (2022).
- Wagner, D. D., Heger, L. A. Thromboinflammation: From atherosclerosis to COVID-19. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 42 (9), 1103-1112 (2022).
- Njeim, R., et al. NETosis contributes to the pathogenesis of diabetes and its complications. J Mol Endocrinol. 65 (4), R65-R76 (2020).
- De Meo, M. L., Spicer, J. D. The role of neutrophil extracellular traps in cancer progression and metastasis. Semin Immunol. 57, 101595 (2021).
- Nakabo, S., Romo-Tena, J., Kaplan, M. J. Neutrophils as drivers of immune dysregulation in autoimmune diseases with skin manifestations. J Invest Dermatol. 142 (3 Pt B), 823-833 (2022).
- Gupta, S., Chan, D. W., Zaal, K. J., Kaplan, M. J. A high-throughput real-time imaging technique to quantify NETosis and distinguish mechanisms of cell death in human neutrophils. J Immunol. 200 (2), 869-879 (2018).
- Nakabo, S., Kaplan, M. J., Gupta, S. Quantification of neutrophils undergoing NET formation and distinguishing mechanisms of neutrophil cell death by use of a high-throughput method. Methods Mol Biol. 2543, 129-140 (2022).
- Singh, J., et al. Moonlighting chromatin: when DNA escapes nuclear control. Cell Death Differ. 30 (4), 861-875 (2023).
- Carmona-Rivera, C., Kaplan, M. J. Induction and quantification of NETosis. Curr Protoc Immunol. 115, 14.41.11-14.41.14 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. J Vis Exp. (175), 62837 (2021).
- Neubert, E., et al. Serum and serum albumin inhibit in vitro formation of neutrophil extracellular traps (NETs). Front Immunol. 10, 12 (2019).
- von Kockritz-Blickwede, M., Chow, O. A., Nizet, V. Fetal calf serum contains heat-stable nucleases that degrade neutrophil extracellular traps. Blood. 114 (25), 5245-5246 (2009).
- Zhao, W., Fogg, D. K., Kaplan, M. J. A novel image-based quantitative method for the characterization of NETosis. J Immunol Methods. 423, 104-110 (2015).
- Papayannopoulos, V. Neutrophil extracellular traps in immunity and disease. Nat Rev Immunol. 18 (2), 134-147 (2018).
