Este método modela la cirugía de cataratas in vivo mediante la extracción de células de fibra del cristalino de ratones adultos y dejando atrás la bolsa capsular con células epiteliales del cristalino (LEC) adjuntas. A continuación, se evalúa la respuesta a la lesión en varios momentos postoperatorios utilizando criterios moleculares y morfológicos.
La cirugía de cataratas (SC) es un tratamiento eficaz para las cataratas, una de las principales causas de discapacidad visual en todo el mundo. Sin embargo, el SC conduce a la inflamación ocular y, a largo plazo, puede dar lugar a una opacificación capsular posterior (OCP) y/o a una luxación del cristalino impulsada por el sobrecrecimiento postquirúrgico de las células epiteliales del cristalino (LEC) y su conversión en miofibroblastos y/o células fibrosas aberrantes. Sin embargo, los mecanismos moleculares por los cuales la CS da lugar a la inflamación y la PCO son todavía oscuros porque la mayoría de los modelos in vitro no recapitulan la respuesta de cicatrización de las LEC observadas in vivo, mientras que los modelos animales tradicionales de cirugía de cataratas, como los conejos, no permiten la manipulación genética de la expresión génica para probar los mecanismos. Recientemente, nuestro laboratorio y otros han utilizado con éxito ratones modificados genéticamente para estudiar los mecanismos moleculares que impulsan la inducción de la señalización proinflamatoria y la transición epitelial de LEC a mesenquimatoso, lo que lleva a nuevos conocimientos sobre la patogénesis del PCO. Aquí, informamos sobre el protocolo establecido para modelar la cirugía de cataratas en ratones, que permite un perfil transcripcional robusto de la respuesta de las LEC a la eliminación de células de fibra del cristalino a través de RNAseq, la evaluación de la expresión de proteínas mediante inmunofluorescencia semicuantitativa y el uso de herramientas modernas de genética de ratones para probar la función de genes que se supone que participan en la patogénesis de secuelas agudas como la inflamación, así como la conversión posterior de LEC en miofibroblastos y/o células aberrantes de las fibras del cristalino.
El cristalino es un tejido transparente altamente organizado que refracta la luz para producir una imagen claramente enfocada en la retina 1,2,3. Este órgano especializado está rodeado por una membrana basal ininterrumpida (la cápsula), que aísla el cristalino de otras partes del ojo. La superficie anterior interna de la cápsula ancla una monocapa de células epiteliales del cristalino (LEC), que luego se diferencian en el ecuador del cristalino en células de fibra del cristalino, que comprenden la gran mayoría del cristalino3. Una catarata ocurre cuando el cristalino pierde su transparencia debido a factores como el envejecimiento, la mutación genética, la radiación UV, el estrés oxidativo y el trauma ocular4. La catarata es una de las principales causas de ceguera en todo el mundo, especialmente en los países con una atención médica deficiente5. Sin embargo, esta afección ahora se trata fácilmente mediante la extirpación quirúrgica de las células opacas del cristalino mediante facoemulsificación en la que se extrae la cápsula central del cristalino y el epitelio adjunto del cristalino, seguido del uso de una sonda vibratoria para romper la masa celular del cristalino en fragmentos más pequeños que se pueden succionar; dejando atrás una bolsa capsular con algunas LEC ecuatoriales adjuntas1. La visión se restaura más comúnmente mediante la implantación postquirúrgica de una lente intraocular (LIO) artificial.
Si bien la cirugía de cataratas (SC) es un tratamiento altamente efectivo y mínimamente invasivo para las cataratas, la recuperación postquirúrgica de un paciente puede verse obstaculizada agudamente por el desarrollo de inflamación ocular 5,6,8. Esta inflamación puede causar dolor postquirúrgico, edema de retina que conduce al desprendimiento de retina, así como exacerbación de otras afecciones inflamatorias y fibróticas como uveítis y glaucoma 4,7,8,9. La inflamación ocular post-CS (PCS) generalmente se trata con colirios antiinflamatorios que están plagados de un mal cumplimiento por parte del paciente o cirugía de cataratas sin gotas que puede conducir a un aumento de la prevalencia de moscas volantes 8,10,11. A largo plazo, los resultados de la CS pueden verse comprometidos por el desarrollo de opacificación capsular posterior (OCP)12. La PCO ocurre cuando las LEC residuales que quedan después de la cirugía experimentan una respuesta de cicatrización de la herida, proliferan y migran a la cápsula posterior del cristalino a los meses o años, contribuyendo a la obstrucción visual secundaria13,14.
La comprensión de los mecanismos moleculares por los cuales el CS da lugar a tales respuestas agudas y crónicas representa un gran desafío en el campo, ya que gran parte de la literatura que investiga el PCO se basa en la inducción de la conversión de LEC a miofibroblastos en cultivo mediante tratamiento con factor de crecimiento transformante activo beta (TGFβ)12,15. Los modelos de bolsas capsulares humanas creados a partir de lentes de cadáver cultivadas in vitro reflejan mejor la biología de las PCS del cristalino, ya que las LEC se cultivan en su membrana basal nativa, pero son difíciles de manipular mecánicamente, no recapitulan el entorno intraocular y son inherentemente variables debido a la variabilidad de lente a lente (o de donante a donante)16,17. Los modelos in vivo de cirugía de cataratasde conejo 1,18 y primates no humanos19,20 superan algunos de estos problemas, pero aún no son fáciles de manipular para los estudios mecanicistas. En particular, un estudio previo de la regeneración del cristalino de los mamíferos encontró una regeneración significativa del cristalino dentro de las cuatro semanas posteriores a la extracción de las células de fibra del cristalino de los ratones, dejando atrás las células epiteliales del cristalino y la cápsula, mientras que no se produjo un recrecimiento del cristalino cuando se extrajo todo el cristalino21,22. Posteriormente, simplificamos este procedimiento y lo optimizamos para el estudio de la respuesta aguda de las LEC a la eliminación de células de fibra del cristalino y su posterior conversión en una población mixta de células con propiedades de miofibroblastos y células de fibra.
Utilizando este modelo murino de cirugía de cataratas, hemos demostrado que las células epiteliales del cristalino remodelan drásticamente su transcriptoma a las 6 horas PCS para producir numerosas citocinas proinflamatorias23, mientras que comienzan a expresar marcadores fibróticos a las 24 h PCS 12,23, antes del inicio de la señalización canónica de TGFβ. Los experimentos mecanicistas en ratones knockout utilizando este modelo revelaron que la expresión de fibronectina celular por parte de las LEC es necesaria para una respuesta fibrótica sostenida PCS, probablemente debido tanto a su papel en el ensamblaje de la MEC fibrótica como a la señalización celular12. Otros estudios mostraron que la αVβ8-integrina es necesaria para la transición de LECs a miofibroblastos debido a su función en la activación de TGFβ, y el potencial de este enfoque para identificar pistas terapéuticas anti-PCO se confirmó ya que un antagonista de αVβ8-integrina también bloqueó LEC EMT15.
Aquí, proporcionamos un protocolo detallado que describe cómo eliminar las células de fibra del cristalino de ratones vivos (Figura 1y Figura 4) mientras se deja atrás la cápsula del cristalino y las LEC para modelar la respuesta de la LEC a la cirugía de cataratas.
Esta técnica quirúrgica requiere un manejo avanzado del ratón y habilidades microquirúrgicas que requieren práctica para desarrollarse. Lo más difícil de dominar es la colocación de suturas finas en la córnea para cerrar la herida. Supongamos que el experimentador es un novato total en la sutura. En ese caso, se recomienda practicar primero el uso de cuerda y tela, luego pasar a practicar el uso de suturas de gran diámetro en frutas pequeñas para dominar los movimientos necesa…
The authors have nothing to disclose.
Este trabajo contó con el apoyo del Instituto Nacional del Ojo (EY015279 y EY028597) y Delaware INBRE (P20 GM103446).
0.5% Erythryomycin opthalmic ointment USP | Baush Lomb | 24208-910-55 | |
1% Atropine sulfate ophthalmic solution | Amneal | 60219-1748-2 | |
1% Tropicamide opthalmic solution USP | Akorn | 17478-102-12 | |
10-0 Nylon suture | Ethicon | 7707G | |
2.5% Phenylephrine hydrochloride ophtahlmic solution USP | Akorn | 17478-200-12 | |
26 G 1/2 Needles – straight | BD PrecisionGlide | 5111 | |
27 G 45° bent dispensing tip 1" | Harfington | ||
Balanced saline solution | Phoenix | 57319-555-06 | |
Bupranorphine (0.1 mg/kg) | APP Pharmaceticals | 401730D | |
Chlorhexidine solution | |||
Needle holder 2-110 | Duckworth & Kent | 2-110-3E | |
Noyes scissors, straight | Fine Science Tools | 12060-02 | |
SMZ800 Nikon model microscope | Nikon | ||
Sterile disposable scalpel No.11 | Feather | 2975#11 | |
Tweezers #5 Dumont | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | |
Xylazine/Ketamine/Acepromazine (35 mg/kg, 80 mg/kg, 0.5 mg/kg) solution | APP Pharmaceticals | 401730D |