Cirugía de bypass duodenal-yeyuno en ratones diabéticos obesos inducidos por la dieta

Todos los pasos del protocolo que se describen a continuación siguen los lineamientos del Comité de Cuidado y Uso de Animales del Hospital General del Comando del Teatro Sur bajo el número de aprobación 2020112501. 1. Preparación preoperatoria general NOTA: Se compraron treinta ratones machos C57BL/6 de 6 semanas de edad. Los ratones se alojaron en un laboratorio libre de patógenos específicos (SPF) bajo un ciclo de luz/oscuridad de 12 h; temperatura, 22 ± 2 °C; y la humedad, 55-65%. Los ratones tuvieron acceso gratuito al agua y se les alimentó con una dieta de 60% de kcal y grasas durante 6 semanas para inducir la obesidad. Se administró una inyección intraperitoneal de 40 mg/kg de estreptozotocina durante 5 días para inducir diabetes17. Entre los treinta ratones, veintidós ratones fueron examinados para determinar si la glucosa en sangre era aleatoria > 300 mg/dL y se asignaron aleatoriamente a los grupos DJB (n = 15) y cirugía simulada (n = 7). Ocho ratones fueron excluidos del experimento debido a una glucosa en sangre por debajo de la norma. Ayuna a los ratones durante 8 h antes de la cirugía. Retirar agua 2 h antes de la cirugía. Administrar solución de pentobarbital sódico al 1% (6 mL/kg) y buprenorfina (1 mg/kg) por vía intraperitoneal. Toque los dedos de los pies o la cola de los ratones con pinzas y asegúrese de que los ratones no muestren ningún espasmo o sacudida evidente. Bajo la anestesia adecuada, los ratones pueden respirar libremente sin oxígeno suplementario. Coloque los ratones en posición supina sobre una tabla estéril y bajo un microscopio estereoscópico. Aplique ungüento para los ojos en los ojos. Use una manta eléctrica para mantener a los ratones calientes durante todo el procedimiento. Use procedimientos estériles, como batas quirúrgicas, guantes estériles e instrumentos esterilizados en autoclave. En ratones de control simulados, hacer las dos incisiones respectivamente en el duodeno 1 cm por debajo del píloro y en el yeyuno 5 cm por debajo del Treitz y luego suturar las incisiones. 2. Bypass duodenal yeyunal: procedimiento quirúrgico Aplicar la pasta depilatoria desde el xifoides hasta el abdomen para eliminar el vello de esta región. Limpie la crema y asegúrese de que la piel esté limpia. Frote el área tres veces con un exfoliante alterno de soluciones de yodo y alcohol. Cubra el ratón con un paño estéril, dejando expuesta la zona operativa, y haga una incisión de 2 cm desde el xifoides hasta el abdomen. Use un retractor abdominal para exponer la cavidad abdominal. Empuje la grasa abdominal con un hisopo de algodón húmedo y mueva el hígado hacia el lado cefálico para exponer completamente el estómago y los intestinos. El estómago y el píloro están debajo del hígado, y el ligamento de Treitz está en el duodeno distal. Ligar dos veces el yeyuno, 5 cm distal al ligamento de Treitz con una sutura de seda 6-0 (Figura 1A). Cortar el yeyuno en el punto medio de las dos ligaduras y suturar el muñón yeyunal con una sutura de seda 10-0 (Figura 1B).NOTA: Evite retorcer los vasos sanguíneos mesentéricos. Tire de la incisión yeyunal proximal 5 cm a lo largo del intestino hasta el yeyuno para crear una anastomosis yeyunal-yeyunal. Alinee los dos intestinos horizontalmente y luego use una sutura de seda 10-0 para crear la anastomosis lateral (Figura 1C).NOTA: Durante la cirugía, mantenga el intestino húmedo con solución salina para reducir la pérdida de agua. Esto evitará que el intestino se enrolle y facilitará la sutura. Asegure ambos extremos del intestino y corte la incisión a la misma longitud (Figura 1D). Suturar la segunda capa de la pared intestinal posterior con una sutura continua de espesor completo.NOTA: La longitud de la incisión es de aproximadamente 0,5-0,6 cm y la distancia de la aguja es de ~0,5 mm. Asegure ambos extremos del intestino y suture la pared anterior del intestino. Suturar la primera capa de la pared anterior con una sutura continua simple y la segunda capa con una sutura horizontal en varo (Figura 1E-F).NOTA: Frote el contenido intestinal con hisopos de algodón para prevenir la infección de la cavidad abdominal. Tire de la incisión yeyunal distal en el duodeno 1 cm por debajo del píloro para crear una anastomosis duodenal-yeyuno (Figura 1G). Suérelo utilizando el mismo método que en los pasos 2.6-2.7 (Figura 1H-K).NOTA: Revise la sutura en la esquina anastomótica para reducir la fuga anastomótica. Lieva el intestino con las micro pinzas y corte el intestino con las micro tijeras. Ligar doblemente el duodeno con una sutura de seda 6-0, a 2 mm del extremo distal de la anastomosis duodenal-yeyunal. Cortar en el punto medio con microtijeras y suturar el muñón con una sutura de seda 10-0 (Figura 1L).NOTA: Los vasos gastroduodenales se ramifican perpendicularmente a la cabeza del páncreas y son adyacentes al píloro, lo que requiere una exploración cuidadosa de los vasos en la sección transversal. Se localizó la confluencia de la colédoca y el duodeno, cuidando de no dañar el páncreas ni la colédoca. Enjuague la cavidad abdominal con solución salina a 30 °C. Regrese el intestino a la cavidad abdominal. Suturar el músculo y la piel por separado con una seda 6-0. A continuación, desinfecta la piel con yodoforo. Después de la cirugía, inyecte solución salina a 30 °C (30 mL/kg) por vía subcutánea en la espalda para prevenir la deshidratación. Inyecte penicilina (10 mg/kg) por vía intramuscular para prevenir la infección. Figura 1: Procedimiento de bypass duodenal-yeyunal. (A) Localización del yeyuno a 5 cm distal del ligamento de Treitz. (B) Ligar dos veces el yeyuno con seda 6-0, cortado por el medio de la ligadura. (C) Anastomosis yeyunal-yeyunal. (D) Hacer una incisión de 0,5-0,6 cm, y suturar la pared posterior. (E-F) Anastomosis yeyunal completa. (G) Tire del yeyunal distal hasta el duodeno 1 cm por debajo del píloro. H) Anastomosis duodenal-yeyunal. (I) Cortar la anastomosis duodenal-yeyunal con una incisión de 0,5-0,6 cm y suturar la pared posterior con una sutura continua simple. (J-K) Anastomosis duodenal-yeyunal completa. (L) A 2 mm desde la anastomosis distal hasta la duodenal-yeyunal, ligar dos veces el duodeno con seda 6-0 y cortar por la mitad de la ligadura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 3. Cuidados postoperatorios generales Después de la cirugía, coloque a los ratones sobre una manta eléctrica para prevenir la hipotermia. Permita que los ratones se arrastren libremente hasta que estén completamente despiertos antes de regresar a sus jaulas. El día del postoperatorio, restrinja la comida y el agua e inyecte 2 mL de suero fisiológico por vía subcutánea en el dorso de los ratones. En el primer día postoperatorio, dar 10 mL de glucosa al 10% y una bebida funcional (proporción 1:1) sin alimentos, e inyectar 1 mL de suero fisiológico por vía subcutánea. En el segundo y tercer día postoperatorio, alimentar a los ratones con una mezcla de 20 mL de glucosa al 10% y una bebida funcional. Después del cuarto día, dale a los ratones agua pura y una dieta alta en grasas. La alimentación transitoria debe realizarse de acuerdo con el estado de recuperación postoperatoria en el siguiente orden: alimento en solución, semilíquido o sólido. Analgesia postoperatoria: inyectar buprenorfina (0,1 mg/kg) cada 12 h desde el día 1 hasta el día 3, y luego una vez al día hasta el día 5. Después de la cirugía, observe las condiciones de alimentación, la actividad, las heces y la cicatrización de las heridas de los ratones. Figura 2: Diagrama de la cirugía de DJB. (A) Anastomosis duodenal-yeyunal. (B) Anastomosis yeyunal-yeyunal. (C) Miembro biliopancreático. (D) Miembro digestivo. e) Miembro común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Anatomía de la cirugía DJB. A) Anastomosis duodenal-yeyunal. (B) Anastomosis yeyunal-yeyunal. (C) Miembro biliopancreático. (D) Miembro digestivo. e) Miembro común. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. 4. Evaluación postoperatoria de parámetros metabólicos Medición del peso corporalAyune los ratones durante 8 h antes de la medición. Pesar a los ratones semanalmente el lunes antes y después de la cirugía durante 8 semanas. Medición de la ingesta de alimentosAlberga un ratón en cada jaula. Mida la cantidad de alimento sólido en cada jaula antes y después de 24 h. La diferencia entre los dos valores representa la ingesta diaria de alimentos. Medición aleatoria de glucosa en sangreA las 8:00 a.m. del lunes semanal de medición, recoja una gota de sangre de la punta de la cola del ratón y aplíquela a una tira de glucosa insertada en el glucómetro. Prueba de tolerancia oral a la glucosaOcho semanas después de la cirugía DJB, ayunar los ratones durante 8 h antes de la prueba de tolerancia oral a la glucosa. Recoja una gota de sangre de la punta de la cola del ratón y colóquela en una tira de glucosa insertada en el glucómetro. Administrar una dosis oral de D-glucosa al 20% (2 g/kg). Mida los niveles de glucosa en sangre a los 0, 15, 30, 60, 90, 120, 150 y 180 minutos después de la sonda nasogástrica.