Utilizzo dell'imaging dal vivo ex vivo per studiare le divisioni e i movimenti cellulari durante il rinnovamento dentale del topo

Negli ultimi due decenni, l’incisivo di topo è emerso come una piattaforma inestimabile per studiare i principi della regolazione delle cellule staminali adulte e della rigenerazione dei denti ^1,2. L’incisivo del topo cresce continuamente e si rinnova per tutta la vita dell’animale. Lo fa mantenendo sia le cellule staminali epiteliali che quelle mesenchimali, che possono auto-rinnovarsi e differenziarsi in diversi tipi di cellule del dente ^1,2. Mentre le cellule staminali epiteliali dentali danno origine ad ameloblasti, che secernono la matrice dello smalto, le cellule staminali mesenchimali dentali danno origine a odontoblasti, cementoblasti e fibroblasti, che formano dentina, cemento e legamento parodontale, rispettivamente 3,4,5,6. Questo apporto costante di nuove cellule mantiene l’omeostasi dei tessuti e consente la sostituzione delle vecchie cellule perse a causa dell’usura masticatoria o delle lesioni ^7,8. Chiarire i meccanismi cellulari e molecolari che regolano il mantenimento e la differenziazione delle cellule staminali dentali è quindi fondamentale per comprendere la rigenerazione dentale, un’area di crescente interesse.

Anatomicamente, gran parte dell’incisivo del topo adulto è racchiuso nell’osso mascellare. Mentre il bordo incisale del dente è esposto, l’estremità apicale dell’incisivo si inserisce all’interno di una presa ed è saldamente attaccata all’osso circostante attraverso i legamenti parodontali e i tessuti connettivi (Figura 1A,B). L’estremità apicale dell’incisivo è anche la regione di crescita del dente e mantiene le cellule staminali dentali e progenitrici sia nello strato epiteliale che nella polpa mesenchimale 9,10,11,12,13. In particolare, le cellule staminali epiteliali dentali sono mantenute all’estremità bulbosa dell’epitelio, nota come gemma apicale, nota anche come ansa cervicale labiale (Figura 1C). Analogamente all’epitelio intestinale e all’epidermide, il rinnovamento epiteliale nell’incisivo è supportato principalmente dalle cellule staminali a ciclo attivo e dai loro discendenti intermedi altamente proliferativi, chiamati cellule di amplificazione del transito 14,15,16,17, entrambe residenti nella parte interna dell’ansa cervicale. Tuttavia, resta da determinare se l’epitelio incisivo contenga e utilizzi cellule staminali quiescenti durante la rigenerazione. Al contrario, nella polpa apicale sono state identificate cellule staminali mesenchimali dentali attive e quiescenti e le cellule staminali quiescenti funzionano come una popolazione di riserva che si attiva durante la riparazione della lesione^13,18.

Molte delle scoperte sulla biologia del rinnovamento e della rigenerazione degli incisivi del topo sono il risultato di indagini istologiche, in cui i campioni vengono ottenuti in giunture temporali distinte, fissati, processati e quindi sezionati in fette sottili come un micron lungo un particolare piano. Attraverso un’analisi dettagliata delle sezioni istologiche di diversi modelli murini che consentono il tracciamento del lignaggio o delle perturbazioni genetiche, gli scienziati hanno identificato i lignaggi cellulari di diverse popolazioni di progenitori, nonché le vie genetiche e di segnalazione che controllano l’omeostasi degli incisivi e la riparazione delle lesioni 19,20,21. Tuttavia, le immagini statiche bidimensionali (2D) di cellule non vitali in sezioni non possono catturare l’intero spettro dei comportamenti cellulari e delle organizzazioni spaziali nei tessuti viventi, come i cambiamenti di forma delle cellule, i movimenti e la cinetica cellulare. Rilevare e misurare questi rapidi cambiamenti cellulari, che si verificano su una scala temporale che non è risolvibile attraverso il sezionamento dei tessuti, richiede una strategia diversa. Inoltre, l’acquisizione di tali informazioni è fondamentale anche per comprendere come le cellule dentali interagiscono tra loro, reagiscono a diversi stimoli di segnalazione e si auto-organizzano per mantenere le strutture e le funzioni dei tessuti.

L’avvento dell’imaging dei tessuti profondi a quattro dimensioni (4D) utilizzando la microscopia a due fotoni²², una tecnologia che integra tre dimensioni spaziali con la risoluzione temporale, supera i limiti intrinseci dell’analisi istologica consentendo l’esame spazio-temporale di espianti di tessuti in coltura, organoidi o persino tessuti in situ 23,24,25,26 . Ad esempio, l’imaging dal vivo 4D dell’epitelio dentale in via di sviluppo ha svelato i modelli spazio-temporali delle divisioni e delle migrazioni cellulari che coordinano la crescita dei tessuti, la formazione del centro di segnalazione e la morfogenesi dell’epitelio dentale 27,28,29,30,31,32. Nell’incisivo di topo adulto, l’imaging 4D è stato recentemente adattato per studiare i comportamenti cellulari durante la riparazione del danno epiteliale dentale. L’imaging dal vivo ha rivelato che le cellule intermedie dello strato soprabasale possono essere convertite direttamente in ameloblasti nello strato basale per rigenerare l’epitelio danneggiato, sfidando il paradigma tradizionale della riparazione del danno epiteliale¹⁵.

Qui, descriviamo la dissezione, la coltura e l’imaging dell’incisivo di topo adulto, concentrandoci sulle cellule epiteliali nell’ansa cervicale labiale (Figura 1). Questa tecnica preserva la vitalità delle cellule dentali per più di 12 ore e consente il monitoraggio in tempo reale delle cellule marcate con fluorescenza con una risoluzione a singola cellula. Questo approccio consente di studiare il movimento e la migrazione delle cellule, nonché i cambiamenti dinamici nella forma delle cellule e nell’orientamento della divisione in condizioni di coltura normali o in risposta a perturbazioni genetiche, fisiche e chimiche.