파지 및 로보틱스 지원 근연속 진화(PRANCE)는 빠르고 강력한 단백질 진화를 위한 기술입니다. 로봇 공학은 실험의 병렬화, 실시간 모니터링 및 피드백 제어를 가능하게 합니다.
로봇 가속 진화 기술은 피드백 제어를 사용하여 진화의 신뢰성과 속도를 향상시켜 단백질 및 유기체 진화 실험의 결과를 개선합니다. 이 기사에서는 PRANCE(Phage- and Robotics-assisted Near-continuous Evolution)를 구현하는 데 필요한 하드웨어 및 소프트웨어 설정에 대한 가이드를 제공합니다. PRANCE는 빠른 파지 기반 분자 진화와 수백 개의 독립적이고 피드백 제어 진화 실험을 동시에 실행할 수 있는 기능을 결합합니다. 이 백서에서는 액체 취급 기기, 플레이트 리더, 보조 펌프, 히터 및 3D 프린팅 용기를 포함한 PRANCE의 하드웨어 요구 사항 및 설정에 대해 설명합니다. Python 기반 오픈 소스 소프트웨어와 호환되도록 액체 처리 로봇을 구성하는 방법을 설명합니다. 마지막으로, 기능을 실행하고 시스템이 다중화 진화를 수행할 준비가 되었는지 검증하는 새로 구성된 PRANCE 시스템으로 수행할 수 있는 처음 두 가지 실험에 대한 제안을 제공합니다. 이 가이드는 로봇 가속 진화 수행과 관련된 상당한 장비 설정을 탐색하기 위한 핸드북 역할을 하기 위한 것입니다.
PRANCE는 두 가지 강력한 유도 진화 기술의 조합입니다. 첫 번째는 PACE1로, 유전자 다양화 및 선택을 M13 박테리오파지의 빠른 수명 주기에 결합하는 분자 기술로, 액체 파지 배양에서 빠른 진화 라운드가 지속적으로 발생할 수 있도록 합니다. 이 선택은 진화하는 단백질의 기능을 pIII, 파지 번식에 필요한 M13의 꼬리 코트 단백질의 발현에 결합하는 플라스미드 인코딩 유전자 회로를 사용하여 주도되며, 이는 그림 1에 설명되어 있습니다. 실험 수준에서, 액체 파지 배양액의 지속적인 희석은 연속적인 선택을 가능하게 합니다. 따라서 선택 엄격성은 유전자 회로 수준뿐만 아니라 파지 배양 희석 속도를 제어하여 실험 수준에서도 조절될 수 있습니다. 따라서 PACE는 pIII 발현을 유도하기 위해 대장균 박테리아에서 원하는 활성을 감지할 수 있는 분자 센서가 있는 모든 생체 분자 엔지니어링 과제에 적용할 수 있습니다. 응용 분야에는 단백질-단백질 결합 2,3,4, 단백질-DNA 결합5, 단백질 용해도6 및 수많은 특정 효소 기능7의 진화가 포함됩니다. 두 번째는 로보틱스 가속 진화 8,9로, 피드백 컨트롤러를 사용하여 지향 진화의 두 가지 일반적인 실패 모드, 즉 환경이 너무 엄격할 때 발생하는 멸종과 환경이 너무 관대할 때 발생하는 진화 부족을 제거합니다. PANCE(Phage-assisted Non-continuous Evolution)7,10에서 수행된 파지의 연속 패시징과 달리, 로봇 가속 “거의 연속적인” 진화는 중간 로그 단계에서 배양을 유지하는 신속한 피펫팅을 포함하여 개체군이 감염 및 전파의 지속적인 주기를 경험할 수 있도록 합니다. 이 두 가지 기술을 함께 사용하면 Phage 및 Robotics-assisted Near-continuous Evolution8의 약자인 PRANCE라고 하며, 이를 통해 강력하고 다중화되며 빠른 연속 진화를 가능하게 합니다. PRANCE는 중합효소, tRNA 및 아미노-아실 tRNA 합성효소를 진화시키고 이러한 진화 과정에서 피드백 제어를 수행하여 속도와 신뢰성을 향상시키는 데 사용되었습니다8.
액체 취급 로봇에서 박테리오파지를 사용할 수 있도록 하는 PRANCE의 하드웨어 및 소프트웨어 설정에 대한 몇 가지 세부 정보가 있습니다. 로봇 제조업체에서 제공하는 기본 소프트웨어를 사용하는 대신 Python 기반 오픈 소스 소프트웨어 패키지11을 사용하여 빠른 동시 실행을 가능하게 하여 반연속 바이오리액터를 중간 로그 단계로 유지할 수 있습니다. 갑판에 있는 여러 구성 요소를 정기적으로 자체 멸균하여 연구원의 휴직 시간을 며칠로 연장할 수 있으며, 이는 이러한 구성 요소를 표백하고 헹굴 수 있는 펌프의 자동 제어를 통해 달성됩니다. 파지 교차 오염은 포스 핏 팁을 사용하지 않는 액체 취급 로봇을 사용하고 액체 취급 설정을 신중하게 조정하여 제거할 수 있습니다.
장비를 표준화하려는 노력에도 불구하고 실질적으로 모든 PRANCE 설정은 장비 공급, 하드웨어 및 소프트웨어 버전 관리의 변경으로 인해 다를 것입니다. 결과적으로 각 PRANCE 설정은 고유한 설정 문제를 나타내며 효과적인 모듈식 문제 해결을 위해 각 구성 요소의 목적에 대한 포괄적인 이해가 필요합니다.
이 방법은 확립된 PRANCE 시스템의 설정 및 테스트를 위한 단계별 프로토콜을 설명합니다. 먼저 하드웨어 및 소프트웨어의 중요한 요소에 초점을 맞춘 다음 시스템이 PRANCE를 사용할 준비가 되었는지 확인하는 일련의 테스트 실행을 준비하고 수행하기 위한 필수 단계를 자세히 설명합니다.
하드웨어의 필수 기능은 박테리오파지를 사용한 다중 실험 중 시료 교차 오염의 위험을 줄이기 위한 최적화입니다. 팁 재사용과 호환되고 포스 핏 팁을 피하여 팁 배출 중에 생성되는 에어로졸을 최소화하는 것으로 생각되는 로봇 팁 기술이 적용된 독점적으로 필터링된 팁을 사용하는 것이 좋습니다. 이 프로토콜에 따라 강력한 팁 세척을 통해 팁을 재사용할 수 있지만 각 시스템에서 감염 테스트의 일부로 적절성을 검증해야 합니다. 자가 멸균은 또한 시스템에 대한 물과 표백제의 일관된 공급에 달려 있습니다. 이들은 탱크/버킷에 보관되며 고갈되면 자가 멸균이 손상되고 급격한 교차 오염이 발생합니다. 특정 펌프 설정이 주어졌을 때 세척 장비가 물과 표백제를 소비하는 속도를 벤치마킹하기 위해 프로그램 실행 전후에 촬영한 탱크/버킷의 사진을 찍을 수 있습니다.
시스템의 또 다른 핵심 요소는 박테리아 성장 단계와 온도를 유지하는 것입니다. PRANCE 실험은 S2060 대장균 박테리아 균주(Addgene: #105064)를 사용하여 수행됩니다. K12 유래 F-플라스미드 함유 균주는 생물막 감소에 최적화되어있다 7. 또한, 이 균주의 F-플라스미드는 플라스미드 유지를 위한 테트라사이클린 저항성 카세트, luxAB 매개 발광 모니터링을 보완하기 위한 luxCDE 및 luxR, 플라크의 비색 시각화를 가능하게 하는 파지 쇼크 프로모터 아래의 lacZ를 추가하여 편집되었습니다. F-플라스미드로 인코딩된 F-필러스는 M13 파지 감염에 필요합니다. 따라서 PACE에 사용되는 박테리아는 37°C에서 F-pilus12가 발현되고 M13 파지 감염, 증식 및 진화가 가능한 중간 로그 단계에서 배양해야 합니다. 정적 온도 조절을 위해 기성품 가열판 캐리어를 사용할 수 있습니다. 대안은 저렴한 히터를 사용하여 HEPA 필터로 들어가는 공기를 가열하는 것이지만 하드웨어의 마모가 가속화될 수 있으므로 권장하지 않습니다. 또한 이것은 사용 시 표백제/물 양동이 및 유도기와 같은 보조 데크 유체의 증발을 가속화합니다.
소프트웨어 패키지의 보정은 적절한 시스템 기능을 위해서도 필수적입니다. 소프트웨어 데크 레이아웃과 실제 로봇 데크 간의 차이는 작동 중 시스템 오류의 가장 일반적인 원인입니다. 연동 펌프 사용은 튜브 마모 및 유체 부피 변화로 이어질 수 있으므로 박테리아 배양, 표백제 및 시스템 배수를 공급하는 보조 펌프의 정기적인 교정이 중요합니다.
물 실행 테스트는 잘못된 액체 취급 설정, 유체 누출/잘못된 연결 및 소프트웨어 불안정을 포함하여 여러 가지 일반적인 설정 문제를 신속하게 보여줍니다. 성공적인 물 공급은 예기치 않은 액체 누출을 나타내지 않고 밤새 오류 없이 안정적으로 작동합니다. 특정 액체 처리 단계를 실행하지 못하거나, 피펫에서 물이 떨어지거나, 실행 중에 프로토콜이 멈추는 등 물 공급 중에 발생할 수 있는 여러 가지 일반적인 문제가 있습니다. 특정 액체 취급 단계를 실행하지 못한 경우 모든 액체 등급이 설치되었는지 확인하십시오. 여기에는 적절한 점도와 피펫팅 속도가 나열되며 제조업체에서 제공하는 로봇 제어 소프트웨어에서 조정됩니다. 피펫에서 물방울이 떨어지는 경우, 깨끗한 피펫팅을 가능하게 하고 파지 교차 오염을 제거하기 위해 로봇 피펫팅 암 설정이 정확해야 합니다. 성공적인 로봇 피펫팅을 위해서는 올바른 액체 등급, 모든 실험기구의 올바른 데크 레이아웃 높이, PRANCE 로봇 분석법 프로그램에 지정된 적절한 피펫팅 높이 오프셋이 필요합니다. 이러한 높이 오프셋은 직접 조정이 필요할 수 있습니다. 프로토콜이 실행 중간에 중지되면 데크 레이아웃 파일이 실제 데크 구성과 일치하지 않을 수 있음을 나타내는 다양한 오류에 의해 생성되는 경우가 많습니다.
박테리아 전용 실행 테스트는 플레이트 리더 설정 및 실시간 데이터 시각화 문제, 과도한 표백제 농도 또는 불충분한 헹굼 문제, 온도 안정성을 보여줍니다. 박테리아 전용 실행에 성공하면 처음 세 주기 동안 석호 흡광도의 평형을 나타내고 실행 기간 동안 안정적인 흡광도가 나타납니다. 또한 몇 가지 일반적인 문제가 드러날 수 있습니다. 이것은 플레이트 리더에 의해 생성된 데이터가 플로팅되는 첫 번째 단계입니다. 플레이트 리더 데이터베이스의 데이터가 제대로 저장되지 않거나 제대로 플롯되지 않을 수 있습니다. 박테리아가 흡광도에서 평형을 이루지 못하면 표백제 농도가 너무 높다는 것을 나타낼 수 있습니다. 과도한 표백제 또는 불충분한 세척은 실험기구 조각뿐만 아니라 전체 실험을 살균할 수 있습니다. 이것이 의심되는 경우 표백제 감지 스트립을 사용하여 석호를 테스트할 수 있습니다. 배양 온도의 안정성은 온도계 건으로 확인할 수 있습니다.
감염 테스트에 성공하면 시스템이 PRANCE를 실행할 준비가 되었음을 나타냅니다. 감염 검사는 박테리아 배양액이 포함된 석호의 하위 집합을 접종하여 수행할 수 있습니다. 이 박테리아는 pIII(ΔgIII)에 대한 유전자가 없는 적절한 파지에 감염되면 pIII를 발현하여 파지 증식을 가능하게 합니다. 테스트를 위한 한 가지 가능한 조합은 임의의 ΔgIII 파지와 함께 파지 쇼크 프로모터 하에서 pIII를 발현하는 플라스미드로 형질전환된 S2060 박테리아를 사용하는 것입니다. 그림 1과 같이 pIII와 luxAB가 T7 promoter(Plasmid pJC173b13)에 의해 구동되는 액세서리 플라스미드로 형질전환된 S2060 박테리아와 함께 야생형 T7 RNA 중합효소를 포함하는 ΔgIII 파지를 사용하는 것이 좋습니다. 이를 통해 테스트 실행 중 플레이트 리더 매개 감염 모니터링도 가능합니다. 감염 검사의 성공과 교차 오염의 부재에 대한 결정적인 증거는 검사 및 대조군 석호의 파지 적정에서 얻을 수 있습니다. 루시페라아제 리포터를 사용하는 경우, 그림 3에서 볼 수 있듯이 테스트 웰에서만 발광이 증가하는 것도 성공적인 파지 감염 및 전파의 지표입니다. 파지 역가 정량화의 황금 표준은 플라크 분석(plaque assay)입니다7. qPCR7에 의한 M13 정량 프로토콜도 더 빠를 수 있지만, 이는 감염성 및 비감염성 파지 입자를 구별하지 않으므로 역가를 과대 평가할 수 있습니다.
메인 프로그램은 매니페스트 파일(일반 텍스트 데이터베이스 파일)을 참조하며, 이 파일은 각 증식 배양물의 사이클당 희석량과 선택 엄격성이 다를 수 있는 잠재적인 박테리아 배양 공급 원료의 선택을 지시합니다. 이러한 방식으로 매니페스트 파일은 PRANCE 실행의 많은 매개 변수를 정의합니다. 이 파일은 작업자 또는 시스템이 실행하는 동안 편집할 수 있으며, 이는 수동 또는 자동 피드백 제어가 적용될 수 있음을 의미합니다.
완벽하게 작동하는 PRANCE 설정의 유용성은 주의 깊게 모니터링되고 통제된 환경에서 대규모 개체군을 빠르게 진화시킬 수 있는 능력에 있습니다. 플레이트 기반 형식은 PRANCE를 더 작은 기성품 turbidostat 기반 시스템14,15을 사용하는 것과 같은 다른 기술과 구별합니다. 플레이트 기반 설정은 추가 로봇 처리 단계와의 쉬운 통합을 용이하게 할 뿐만 아니라 원심분리기와 같은 다른 실험실 기기와의 호환성을 용이하게 합니다. 또한 여러 인스턴스에서 동시에 가속 진화를 수행할 수 있는 기능은 실험에 또 다른 차원을 도입하여 다양하고 강력한 결과를 얻을 수 있는 가능성을 높입니다. PRANCE에 필수적인 세분화된 제어 및 피드백 시스템은 실험의 예측 가능성과 신뢰성을 더욱 강화하여 유도 진화 기술 분야에서 상당한 발전을 이루었습니다. 그러나 이 기술은 수행할 수 있는 병렬 실험의 수가 제한되어 있습니다. 구성에 따라 PRANCE 설정은 일반적으로 로봇 피펫팅 속도 또는 사용 가능한 데크 공간에 의해 제한됩니다.
PRANCE에 사용된 것과 동일한 하드웨어와 소프트웨어를 박테리오파지를 사용하지 않는 진화 방법에도 적용할 수 있습니다. 다중탁도스탯(many-turbidostats) 방법11에서 입증된 바와 같이, 이 동일한 기기는 박테리아에만 사용할 수 있으며, 전체 게놈 적응 진화 실험을 가능하게 합니다. 이러한 적응성은 이 장비의 범위를 넓혀 새로운 형태의 로봇 가속 진화를 위한 길을 열었습니다.
The authors have nothing to disclose.
하드웨어 및 소프트웨어 설정에 대한 도움과 조언을 해주신 Emma Chory와 Kevin Esvelt에게 감사드립니다. 사미르 아우제인(Samir Aoudjane), 오사이드 아더(Osaid Ather), 에리카 드베네딕티스(Erika DeBenedictis)는 스틸 펄롯 초기 조사관 보조금(Steel Perlot Early Investigator Grant)의 지원을 받습니다. 이 연구는 영국 암 연구(Cancer Research UK, CC2239), 영국 의학 연구 위원회(UK Medical Research Council, CC2239) 및 웰컴 트러스트(Wellcome Trust, CC2239)로부터 핵심 자금을 지원받는 프랜시스 크릭 연구소(Francis Crick Institute)의 지원을 받았습니다.
3D printed bacterial reservoir "waffle" | – | – | https://drive.google.com/file/d/16ELcvfFPzBzNSto0xUrBe-shi23J9Na7/view; For Robot deck |
3D printer | FormLabs | Form 3B+ | 3D printer components |
3D printer resin (clear) | FormLabs | RS-F2-GPCL-04 | consumable for 3D printer |
8-1,000 µL head | Hamilton | 10140943 | For Liquid handling robot |
96-1,000 µL pipetting head | Hamilton | 10120001 | For Liquid handling robot |
Black polystyrene plate reader microplates | Millipore Sigma | CLS3603 | For Robot deck |
BMG Labtech Spectrostar FLuorstar Omega | BMG Labtech | 10086700 | For Liquid handling robot |
Cleaning solution | Fluorochem Limited | F545154-1L | used to clean the liquid handling parts of the robot |
Deep Well plates | Appleton Woods | ACP006 | these are used to contain evolving bacteria on the deck of the robot |
encolsure heater | Stego | 13060.0-01 | heats inside robot enclosure |
Hamilton STAR | Hamilton | 870101 | For Liquid handling robot |
Heater | Erbauer | BGP2108-25 | For Liquid handling robot |
HIG Bionex centrifuge | Hamilton | 10086700 | For Liquid handling robot |
iSWAP plate gripper | Hamilton | 190220 | For Liquid handling robot |
laboratory tubing | Merck | Z280356 | to construct liquid handling manifold |
luer to barb connector | AIEX | B13193/B13246 | for connectorizing tubing |
Magnetic stir plate | Camlab | SKU – 1189930 | For Auxiliary Fridge |
Molcular pipetting arm | Hamilton | 173051 | For Liquid handling robot |
Omega | BMG labtech | 5.7 | plate reader control software |
One way Check Valves | Masterflex | MFLX30505-91 | to one way sections of liquid handling manifold |
pyhamilton | MIT/Open source | https://github.com/dgretton/std-96-pace%20PRANCE | open source python robot control software |
pymodbus | opensource | 3.5.2 | python pump software interface |
Refrigetator | Tefcold | FSC175H | allows cooled bacteria to be used instead of turbidostat |
S2060 Bacterial strain | Addgene | Addgene: #105064 | E. coli |
temperature controller | Digiten | DTC102UK | Used to control heaters thermostatically |
Thermostat switch controller | WILLHI | WH1436A | WILLHI WH1436A 10 A Temperature Controller 110 V Digital Thermostat Switch Sous Vide Controller NTC 10K Sensor Improved Version; for Liquid handling robot |
Venus | Hamilton | 4.6 | proprietary robot control software |
Wash Station for MPH 96/384 | Hamilton | 190248 | For Liquid handling robot |
Suggested pump manufacturers | |||
Company | Catalog number | Notes | Documentation |
Agrowtek | AD6i Hexa Pump | https://www.agrowtek.com/doc/im/IM_ADi.pdf | |
Amazon | INTLLAB 12V DC | ||
Cole-Parmer | EW-07522-3 | Masterflex L/S Digital Drive, 100 RPM, 115/230 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |
Cole-Parmer | EW-07554-80 | Masterflex L/S Economy variable-speed drive, 7 to 200 rpm, 115 VAC | https://pim-resources.coleparmer.com/instruction-manual/a-1299-1127b-en.pdf |