JoVE Journal > Biochemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioquímica

Harwell ve Beamline VMXi'deki Kristalizasyon Tesisi Kullanılarak Kristalizasyon ve Yerinde Oda Sıcaklığı Veri Toplama, Elmas Işık Kaynağı

Published: March 08, 2024
doi:
10.3791/65964
, , , ,
1Diamond Light Source Ltd,Harwell Science and Innovation Campus, 2Research Complex at Harwell,Harwell Science and Innovation Campus

Summary

Harwell’deki Araştırma Kompleksi’ndeki kristalizasyon tesisini kullanarak proteinlerin kristalleştirilmesi için bir protokol sunuyoruz ve ardından Diamond’ın Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ (VMXi) ışın hattındaki plakalar içindeki kristallerden yerinde X-ışını kristalografik veri topluyoruz. Numune gereksinimlerini, kristalizasyon protokollerini ve veri toplama yönergelerini açıklıyoruz.

Abstract

Harwell’deki Kristalizasyon Tesisi kullanılarak robotik protein kristalizasyonu ve Elmas Işık Kaynağı ışın hattı VMXi’deki kristalizasyon plakalarından yerinde oda sıcaklığında veri toplama protokolleri açıklanmaktadır. Bu yaklaşım, yüksek kaliteli oda sıcaklığındaki kristal yapıların birden fazla kristalden basit bir şekilde belirlenmesini sağlar ve kristalizasyon denemelerinin sonuçları hakkında çok hızlı geri bildirim sağlamanın yanı sıra seri kristalografiyi mümkün kılar. Protein yapısını, ligand bağlanmasını ve dinamiklerini anlamada oda sıcaklığı yapılarının değeri, yapısal biyoloji topluluğunda giderek daha fazla kabul görmektedir. Bu boru hattına, çeşitli erişim modlarıyla dünyanın her yerinden kullanıcılar erişebilir. Kurulan kristalizasyon deneyleri, bir makine öğrenimi aracı kullanılarak otomatik olarak tanımlanan kristallerle uzaktan görüntülenebilir ve görüntülenebilir. Veriler, bir plakadaki kullanıcı tarafından seçilen kristallerden 60°’ye kadar dönüş veri kümelerine sahip kuyruk tabanlı bir sistemde ölçülür. Belirli bir kuyu veya numune grubundaki tüm kristallerden gelen veriler, bir web tarayıcısı arayüzü aracılığıyla doğrudan erişilen çıktılarla xia2.multiplex kullanılarak otomatik olarak birleştirilir.

Introduction

X-ışını kristalografisi, protein yapısını ve işlevini anlamak için önemli bir araç olmaya devam ediyor ve proteinlerin veya komplekslerinin, örneğin substratlar veya ilaç adayları ile yüksek çözünürlüklü yapılarını sağlıyor. Bununla birlikte, birçok durumda, arzu edilen özelliklere sahip kristallerin elde edilmesi – yüksek derecede kırılan, ıslatmaya uygun kristal formu ve ikizlik gibi kristal patolojileri olmayan – önemli bir darboğaz olmaya devam etmektedir1. Protein kristalleri üretmek için uygun kimyasal koşullar genel olarak tahmin edilemediğinden, binlerce potansiyel kimyasal karışımı araştıran kristalizasyon taraması standarttır ve genellikle kaydedilen kristalleşme damlası görüntülerinin izlenmesi için ekranların ve kristal otellerin ayarlanmasında otomasyon/robotik tarafından desteklenir.

Kristaller ortaya çıktığında, tipik olarak bir naylon veya Kapton halkası kullanılarak kristalizasyon ortamından hasat edilmeli ve daha sonra sıvı nitrojene daldırılarak dondurulmadan önce bir kriyoproteksiyon maddesi (arama ek bir değişkendir) içeren bir damlacığa aktarılmalıdır. Kristalizasyon ve X-ışını verilerinin toplanması arasındaki bu ek adımlar, diğer faktörlerin yanı sıra, kapalı ortamı bozulduğunda kristalleşme damlasının dehidrasyonunu, işlendiğinde kristal üzerindeki mekanik gerilmeleri ve kriyoproteksiyon ajanlarının kristal kafese verdiği hasarı (tipik olarak mozaik yayılımının artmasına neden olur) içerebilir2. Ek olarak, kristal hasadı zaman ve emek yoğundur ve özellikle hasat işlemi sırasında damlalar üzerinde cilt oluştuğunda, numuneler arasında homojensizliğe yol açabilir. VMXi ışın hattı, plakaya yapışan kristallerden kullanılabilir verilere erişim sağlar, aksi takdirde veri toplama için atılır.

X-ışını kristal yapılarının büyük çoğunluğu, yukarıdaki yaklaşım kullanılarak 100K’da belirlenir, bu da basit kristal taşınmasını ve işlenmesini sağlar ve X-ışını ışınında kristal ömrünü büyüklük sırasına göre artırır. Bununla birlikte, kriyojenik olmayan koşullar altında, yani protein fonksiyonu 2,3,4 ile ilgili fizyolojik koşullara çok daha yakın yapıların belirlenmesine artan bir ilgi vardır. Bu, proteinlerin dinamik yapısının çok daha iyi değerlendirilmesini sağlar, amino asit konformasyonlarının veya döngülerinin işlevsel olarak ilgisiz durumlardadondurulmasını önler 5 ve ligand bağlanmasının hücre ve organizma içindeki proteinin doğal ortamındakilere çok daha yakın koşullar altında araştırılmasını sağlar6.

Birleşik Krallık’taki Elmas Işık Kaynağı senkrotronundaki Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi yerinde (VMXi) ışın hattında uygulanan alternatif bir yaklaşım, kırınım verilerini doğrudan kristallerden büyüdükleri ortamdaki (yani kristalizasyon plakası içinde), ortam koşulları altında ve bozulmadanölçmektir 7,8. Bu, kristalizasyon ekranlarından ve optimizasyonlardan çok hızlı geri bildirim sağlayarak kullanıcıyı gereksinimleri için en uygun kristal formuna yönlendirir. Ayrıca, yüksek kaliteli oda sıcaklığındaki yapıların otomatik bir şekilde üretilmesini sağlar9.

Bu protokol, bir kullanıcının kristalleşmeye hazır oldukça saf bir protein örneğine sahip olduğunu varsayar. Protein kristalleri üretmek için Harwell’deki Kristalizasyon Tesisine erişen kullanıcı deneyimini açıklıyoruz ve ardından veri toplama için ışın hattı VMXi’yi kullanıyoruz (Şekil 1).

Harwell’deki Kristalizasyon Tesisi

Harwell’deki (CF) Kristalizasyon Tesisi, Elmas Işık Kaynağının bitişiğindeki Harwell’deki (RCaH) Araştırma Kompleksinde yer almaktadır. Tesis, kullanıcılara kristalizasyon taraması, kristal optimizasyonu, kristal görüntüleme ve karakterizasyon için robotik kullanan makromoleküler kristalizasyon için yüksek verimli otomatik bir laboratuvar sunmaktadır. Yüksek düzeyde otomatikleştirilmiş VMXi ışın hattı ile yakın entegrasyon sayesinde, oda sıcaklığı yapılarını belirleme hızı büyük ölçüde hızlandı ve tümü kriyojenik olmayan koşullar altında yeni protein yapılarının, protein-ligand ve DNA-ligand komplekslerinin yanı sıra otomatik parça taramasının (Şekil 1) karakterizasyonunu mümkün kıldı.

CF boru hattı, çözünür ve membran proteinlerinin kristalizasyonu için nanolitre kristalizasyon robotları9 , ticari kristalizasyon ekranları ve karmaşık özel optimizasyon ekranları hazırlamak için sıvı işleme robotları ve kristalizasyon plakalarının görüntülenmesi için dört görüntüleme cihazını (biri 4 °C’de ve üçü 20 °C’de (bkz .). Bir görüntüleyici, lipid kübik fazlı (LCP) cam plakaları görüntüleyebilir ve bir görüntüleyici, çoklu floresan optiklerle donatılmıştır (her ikisi de 20 °C’de).

Tesis şu anda Membran Protein Laboratuvarı (MPL; https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/MPL.html), XChem parça tarama tesisi 10, MX ışın hatları, XFEL-hub ve Rosalind Franklin Enstitüsü (RFI). Bu iyi kurulmuş ve optimize edilmiş boru hattı, kristalizasyon deneylerinin geniş bir yapısal biyoloji projesi yelpazesinde gerçekleştirilmesini sağlamıştır. Bu makale, VMXi’de veri toplamaya yönelik kristaller için boru hattını açıklamaktadır, ancak kristaller ayrıca hasat edilebilir ve kriyo soğutulabilir veya XChem boru hattına yönlendirilebilir.

Kullanıcı erişimi Diamond MX teklif sistemi (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Synchrotron-Access.html) aracılığıyla tahsis edilir ve endüstriyel kullanıcılar Diamond Industry Liaison grubu aracılığıyla desteklenir. Tüm kullanıcılar, elle taşınabilen numune(ler)i veya plakaları ile sahaya gelebilirler. Deneyimlerimiz, damlaların dağıtıldıkları yerden uzaklaşabileceğini veya damlaların kristalleşme rezervuarından zarar görebileceğini gösterdiğinden, plakaların kurye ile gönderilmesi önerilmez. Alternatif olarak, düzenleme gereği, kullanıcılar protein örneklerini CF’ye gönderebilir ve burada personel üyeleri kendi adlarına kristalizasyon deneyleri yapabilir. Deneyler, CF durumunda Rock Maker Web’de oturum açarak veya VMXi durumunda ISPyB aracılığıyla kullanıcı tarafından uzaktan izlenebilir. CF’ye erişim, Diamond’da toplanan X-ışını kırınım sonuçlarına dayalı olarak yinelemeli bir şekilde gerçekleştirilebilir.

Elmas Işık Kaynağında Işın Hattı VMXi

Beamline VMXi (bundan böyle “ışın hattı” olarak anılacaktır), uygun kristalizasyon plakaları içindeki kristallerden gelen verileri ölçmeye odaklanan, tamamen oda sıcaklığında, yüksek düzeyde otomatikleştirilmiş X-ışını kristalografisine adanmış benzersiz ve yakın zamanda geliştirilmiş bir cihazdır. Işın hattı, ~2 × 10 13 foton/sn (16 KeV’de) yüksek akı ile bir mikro odak (10 x 10 μm), pembe ışın (<5 ×10-2 ΔE/E bant geçişi) sunar7. Bu yüksek akı ışını, hızlı bir dedektörle birleştiğinde, numunelerin çok yüksek verimini ve 10 μm’nin üzerindeki numunelerden veri toplanmasını sağlar.

Kristalizasyon plakaları, bir numune depolama sisteminde saklanarak ışın hattına girer ve ISPyB11 arayüzü SynchWeb12 kullanılarak plakalar kaydedilirken kullanıcı tarafından sağlanan programa göre görüntülenir. Tipik olarak, kullanıcıların görüntüleme için bir Fibonacci zaman noktası dizisi seçmeleri önerilir (0, 12, 24, 36, 60… Sisteme girilen plakadan itibaren 7,320 saat). Bir plaka görüntülendikten sonra kullanıcı e-posta ile bilgilendirilir. Hem görünür ışık hem de UV ışığı görüntüleme, talep üzerine kullanıcılar tarafından kullanılabilir. Örnek depolama sistemi tarafından alınan görüntüler bir makine öğrenimi algoritması ile analiz edilir; Bu, kristallere benzeyen nesnelerin ilgi noktalarını otomatik olarak bulur ve tanımlar ve kullanıcının veri toplama için bir kuyruğa eklemesi için hazır olan ilgi noktalarını kaydeder. Kullanıcılar ayrıca ilgi çekici noktaları kaydetmek için görünür ışık görüntülerine manuel olarak tıklayabilir veya raster tarama ile analiz edilecek bir bölgeyi tıklayıp sürükleyebilir. Bu noktalar, otomatik olarak bulunan noktaların yanı sıra kullanıcıların kuyruğa eklemesi için kullanılabilir.

Tüm numuneler veri toplama için uygun parametrelere sahip olduğunda, plaka bir kuyruğa girer. Plaka kuyruğun tepesine ulaştığında, otomatik olarak ışın hattına dağıtılır. Kristalizasyon plakaları, kristal otellerden ışın hattına robotik bir kol tarafından otomatik olarak yüklenir ve görüntü eşleştirmeyi takiben, kullanıcı tanımlı talimatlara göre seçilen her kristalden 60°’ye kadar dönüşe sahip kristalografik veri setleri ölçülür. Bir plaka içindeki tüm damlalar, ışın hattı üzerindeki bu deneyler için kullanılabilir. Veriler, otomatik bir şekilde izomorf, optimal olarak birleştirilmiş veri kümeleri üretmek için birden fazla kristalden birleştirilir 7,9. Kuyruğa alınan tüm veri kümeleri toplandıktan sonra, kullanıcıya, diğer Diamond MX ışın hatlarında olduğu gibi ISPyB11’deki veri kümelerini görüntülemek için takip etmesi gereken bir bağlantı içeren bir e-posta gönderilir. Kullanıcılar ayrıca beamline web sayfasına (https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/VMXi.html) yönlendirilir.

Protocol

1. Harwell’deki Kristalizasyon Tesisini kullanarak yerinde plakalar içinde kristaller üretmek NOT: CF’ye erişim bir dizi farklı yolla desteklenir ve projenin uygulanmasına ve kullanıcı türüne (akademik veya endüstri) bağlıdır. XChem ve MPL projeleri, Kullanıcı Yönetim Sistemi (UAS) aracılığıyla kendi teklif başvuru sistemlerine sahiptir ve standart erişim yolu (iNEXT Discovery ve EUbOPEN dahil) veya BAG Erişimi aracılığıyla sunulabilir. Aşağıdaki protokol VMXi kullanıcılarına özeldir. Teklifin sunulması ve ziyarete hazırlıkBir BAG teklif başvurusuna proje hakkında bilgi verin veya aktif bir BAG teklifine ekleyin. Genellikle evrak işlerini organize eden bir BAG koordinatörü vardır. Alternatif olarak, ışın hattına erişim için hızlı bir erişim teklifi gönderin. Sahaya varmadan önce kurye veya şahsen numunenin UAS’ta kaydedildiğinden ve güvenliğin doğrulandığından emin olun. Kullanıcının kayıtlı olduğundan emin olun (FedID ve parola ile). Kullanıcının, BAG koordinatörü tarafından UAS’de bir ortak olarak bir MX teklifine eklendiğinden emin olun. Işın hattı kristalizasyon numune ayrıntıları formunu doldurun ve formu VMXi@diamond.ac.uk’a gönderin. Deney gereksinimleri ve ışın hattı kullanılabilirliği hakkında ışın hattı personeli ile iletişim kurun. Protein numuneleri gönderilirse, numuneleri yalnızca önceden ayarlanarak gönderin. Ayrıntılar için bölüm 1.2’ye bakın. Kullanıcı, CF’de kristalizasyon plakaları kurmak için sahaya gelecekse, tesis enstrümantasyonunu kullanmak için bir zaman aralığının mevcudiyeti hakkında tesis personeline danışın ve bölüm 1.2.1’i izleyin. Kullanıcı sahaya plakalar getirirse, numunenin doğru plaka tipine dağıtıldığından emin olun ve kristalizasyon damlalarını doğru yere ve doğru miktara yerleştirin. Bölüm 1.2.2’yi takip edin. Işın hattı sadece belirli yerinde kristalizasyon plakalarını kabul eder (Greiner CrystalQuickX ve MiTeGen In Situ-1); damlaların 200 nL’den büyük olmadığından emin olun. CF’de yapılan kristalizasyon deneyiNOT: Tesis, buhar difüzyonunun yanı sıra yağ ve LCP altında kesikli kristalizasyon gibi bir dizi yüksek verimli makromoleküler kristalizasyon yöntemi sunmaktadır. 70-100 μL saf protein ile başlanması ve 100 nL protein çözeltisi ve 100 nL kristalizasyon rezervuar çözeltisi oranı kullanılarak üç ekranlı çözünür proteinler için buhar difüzyon deneylerinin yapılması ve plakaların 20 °C’de inkübe edilmesi önerilir. Tesis içerisinde bir dizi ticari ekran mevcuttur. Nem ve sıcaklık kontrolü en çok kullanılan 4 °C ve 20 °C ile mevcuttur. CF’yi ziyaret eden kullanıcılar, kristalizasyon enstrümantasyonunun çalıştırılması için standartlaştırılmış eğitim ve destek alırlar ve burada açıklanan ayarları kullanırlar.CF’de kurulum için nakliye örnekleriNOT: Sahaya varmadan önce, protein numunesi UAS sistemi içindeki bir teklifle doğrulanmış olmalıdır. Protein numunesi sahaya ulaştıktan sonra, personel üyeleri, kullanıcıyla önceki iletişimlerde belirtildiği gibi kristalizasyon deneyleri yapacaktır. Deneysel kristalizasyon plakaları için barkod bilgileri ile onay e-posta yoluyla gönderilecektir. Kullanıcıdan kristalizasyon plakalarını ilgili teklife kap olarak eklemesi istenecektir. Bu yapıldıktan sonra, plakalar kristalizasyon tesisindeki veya ışın hattındaki otomatik görüntüleyicilerde saklanabilir. ISPyB, ışın hattında etkileşim için kullanılan arayüz olacaktır.Protein numune çözeltisini, 25 μL’lik alikotların katları halinde kristalizasyon konsantrasyonunda sağlayın. Protein örneğini içeren örnek tüplerini açıkça etiketleyin. Gerekirse, bir protein tampon çözeltisi, ligand çözeltisi veya rezervuar çözeltisi sağlayın. Tesis personeline hangi ekranların ve düşme oranlarının kullanılması gerektiğini bildirin. Kristalizasyon plakası ayarlarıNOT: Greiner CrystalQuickX ve MiTeGen In Situ-1 plakasındaki kristalleşme damlalarının belirli bir yerde olmasını şart koşuyoruz; başka bir yere kurulan plakalar, burada açıklanan aşağıdaki Sivrisinek13 ayarlarını kullanmalıdır.MiTeGen In Situ-1 için plaka tanımını ayarlamak için, Mosquito SPT yazılımını açın ve Kurulum | 96 Kuyu | MiTeGen In Situ-1 (96 x 2 damla) (Şekil 2A). Düzenle düğmesine tıklayın ve alt kuyu 2 konumu için değerleri değiştirin: X Ofset – 1,2 ve Y Ofset 1,8 ve alt kuyu 3 konumu için: X Ofset 1,3 ve Y Ofset 1,8 (Şekil 2B,C). Greiner CrystalQuickX için plaka tanımını ayarlamak için Mosquito SPT yazılımını açın ve Kurulum | 96 Kuyu | Greiner CrystalQuickX (Şekil 2D). Düzenle düğmesine tıklayın ve alt kuyu 1 konumu için değerleri değiştirin: X Ofset – 1,95 ve Y Ofset 1,45 ve alt kuyu 2 konumu için: X Ofset 1,95 ve Y Ofset 1,45 (Şekil 2E,F). 2. Işın çizgisini Elmas Işık Kaynağında Kullanma NOT: Kullanıcılar tarafından ışın hattı ile tüm etkileşim, ISPyB11 arayüzü kullanılarak uzaktan gerçekleştirilir. Işın hattında fiziksel bir mevcudiyet gerekmez ve veriler belirli bir zamanda planlanmak yerine kuyruk tabanlı bir sistem kullanılarak toplanır. Kullanıcılar, Elmas Işık Kaynağı erişimleriyle ilişkili bir teklife sahip olacaklar. Işın hattında, her kristalizasyon plakasına benzersiz bir ziyaret atanır ve ISPyB11 içinde 100 K’da numune içeren bir diske benzer bir ‘kap’ olarak tanımlanır. Plaka sahibi, plaka tamamlandı bildirimlerinin yanı sıra görüntüleme ile ilgili e-postalar alacağından, plakayı kaydeden kişinin e-posta adresini kontrol etmesi gerekecektir. Plakaların kaydedilmesiUygun bir Diamond FedID ile ISPyB’de oturum açın ve Teklifler’i seçin. Kaydırarak veya arama çubuğuna teklif numarasını yazarak ilgilendiğiniz teklifi arayın. Teklif numarasının (Şekil 3A) altındaki açılır menüden Gönderi’yi seçin ve bu teklifteki gönderileri içeren Gönderiler penceresi açılacaktır. Yeni Gönderi Ekle penceresini açmak için sağ üst taraftaki +Gönderi ekle’ye tıklayın (Şekil 3B), gönderiye bir Ad verin, Otomatik/Görüntüleyici’ye tıklayın ve ardından sol alttaki Gönderi Ekle düğmesine tıklayın (Şekil 3C). Gönderi penceresinde (Şekil 3D), ardından Konteyner ekle sayfa görünümünü görüntüleyecek olan +Konteyner Ekle’ye tıklayın (Şekil 3E). Konteyner tipi açılır menüsünde ilgili plaka tiplerinden birini seçin. Sayfa, seçilen kapsayıcı türünü yansıtacak şekilde değişir. Deney plakalarına özel ışın hattı personelinden gelen e-posta talimatlarına göre bir Barkod ve Konteyner adı girin. Büyük/küçük harfe duyarlı olduğunu unutmayın. İstenen Görüntüleyici açılır menüsünden VMXi 20 °C görüntüleyiciyi, Görüntüleme Programı açılır menüsünden Fibonacci görüntüleme programını, Kristalizasyon Ekranı açılır menüsünden kristalizasyon ekranını ve Sahip açılır menüsünden kullanıcı adını seçin, Görüntüle düğmesine tıklayın ve E-posta kutusuna doğru iletişim e-posta adresini girin (Şekil 3F). Yorumlar kutusuna plaka hakkında daha fazla ayrıntı girin. Protein açılır menüsünden ilgili numuneyi seçin ve UAS’de kayıtlı ve deneysel teklifte Diamond tarafından onaylanan kısaltmayı kullanın. Örnek Ad kutusuna aynı adı girin; Kalan kutuları boş bırakın. Örneği tüm plaka üzerinde çoğaltmak ve tüm kabı yeşil karelerle doldurmak için +Plaka simgesine tıklayın. Plakayı kaydetmek için sayfanın altındaki +Kapsayıcı Ekle’ye tıklayın. Işın hattındaki bir personelden plakayı saklanacağı ve görüntüleneceği uygun görüntüleyiciye aktarmasını isteyin. Kap görüntüleyicilerde saklandığında bir ziyaret oluşturulacak ve kullanıcı, plakaya ve görüntülerine bir bağlantı içeren bir e-posta alacaktır. Görüntüleme sonuçlarını görüntülemeİlgilendiğiniz teklife gidin (adım 2.1.1), teklif numarasının altındaki açılır menüden Kapsayıcılar’ı seçin ve teklif için kullanılabilir kapsayıcıların listesini gözlemleyin. Başka numune tutucu türleri varsa filtre Plakalarını seçin. Aramayı daha da daraltmak için, yalnızca oturum açmış geçerli kullanıcı kimliğiyle ilişkili en alakalı kapsayıcıları görüntülemek için Kapsayıcılarım kutusunu işaretleyin. İmleci tek tek satırın üzerine getirerek ve fareye sol tıklayarak uygun kapsayıcıya tıklayın. Kabı seçtikten sonra, plakaya genel bir bakış gösteren yeni bir görünüm sunulacaktır (Şekil 4A). İlgili damladan en son görüntüyü göstermek için ekranın sol tarafındaki plaka gösterimindeki bir damlaya tıklayın. Damlalar arasında gezinmek için ok tuşlarını kullanın veya fare/imleç kullanarak tek tek damlaları seçin. Bir düşüşün geçmiş görüntülerini görüntülemek için, H düğmesine tıklayın ve mevcut kuyu damlası görüntüsünün üzerinde bir açılır resim galerisinin görünmesini bekleyin. Ana bırakma görüntüsünü güncellemek için imleci tek tek görüntülerin üzerine getirin. 0 – 9 düğmelerine basarak her düşüşün durumunu belirtmek için görüntüleri puanlayın. Kategorileri tek tek görmek için, açılan resmin sol üst köşesindeki Puan açılır menüsünü açın. Görüntülerde “kristaller” aramak için eğitilmiş bir algoritmanın (CHiMP) sonucu olan damla görüntülerin her birinde mavi çarpı işaretleri arayın. Bir ölçüm aracına erişmek için açılan görüntünün sağ üst tarafındaki Ölç adlı üçüncü simge düğmesine tıklayın. Bu aracı kullanmak için bir çizgiyi tıklayıp sürükleyin, bir cetvel uzayacak ve mesafeyi μm cinsinden verecektir. Ek bir görüntüleme oturumu talep etmek için, sayfanın alt kısmına doğru giden Eylemler’in yanındaki açılır kutudan Görünür veya UV’ye tıklayın. Ardından, Plaka Görüntüleme İste düğmesine tıklayın. Kristal seçimi/CHiMPVeri toplama noktalarını manuel olarak eklemek için +İşaretle düğmesine basın. İmleci istediğiniz ilgi noktasının üzerine getirin ve seçin. Kırmızı bir çarpı işaretinin görünmesini bekleyin.NOT: Damla başına en fazla 100 nesne oluşturulabilir. Tüm noktalar işaretlendiğinde, +Bitir düğmesini tıklayın. Nesneleri ölçmeye çalışmadan önce +Bitir düğmesini de tıklamayı unutmayın. Izgara taramaları yoluyla veri toplama için bölgeler eklemek üzere +Bölgeyi İşaretle düğmesini tıklayın. Işın çizgisi üzerinde raster taranacak bir bölge oluşturmak için sol üst noktaya tıklayın ve aşağı ve sağa sürükleyin. Noktalarda olduğu gibi, istenen tüm bölgeler oluşturulduğunda +Bitir düğmesine tıklayın.NOT: Birçok küçük bölgeden daha büyük bir bölge oluşturmak daha iyidir. Kristal nesneleri (CHiMP) otomatik olarak bulmak için tasarlanmış bir algoritmanın sonucu olan damla görüntülerdeki mavi çarpıları gözlemleyin. Kristalleşme damlalarının CHiMP değerlendirmesini görselleştirmek için, Otomatik Puanları Göster onay kutusunu tıklatın ve ardından Sınıf açılır menüsünü değiştirin. Tipik olarak, buradaki en kullanışlı ayar kristal seçeneğidir (Şekil 4B).NOT: Bu yeni bir özelliktir ve tüm kristalleri bulması garanti edilmez ve kristal olmayan diğer nesneleri de bulabilir. İlgili damlalarda tüm noktalar ve bölgeler işaretlendiğinde, sayfanın altındaki Veri Toplamaya Hazırla düğmesine tıklayın. Veri toplama için numunelerin hazırlanmasıÖnceki adımda seçilen veya otomatik olarak bulunan noktaları veya bölgeleri içeren örneklerin listesini gözlemleyin (Şekil 4C). + düğmesine basarak tek tek noktalar veya bölgeler ekleyin veya Geçerli Sayfayı Kuyruğa Ekle düğmesini tıklatarak görüntülenen tüm örnekleri ekleyin. Filtreler yalnızca Nokta, Bölge, Otomatik noktalar veya Manuel noktaları göstermek için kullanılabilir. Yalnızca çekilmemiş (yani X-ışınlarına maruz kalmış) örnekleri göstermek için, filtre düğmelerinin üzerindeki Veri Olmadan ve Tamamlanmadı seçeneklerini tıklatın. İlgili satıra tıklayarak tek tek örnekleri seçin ve doğru düşüşü ve tek noktayı göstermek için ekranın sağ tarafındaki görüntüyü güncelleyin. Listede çok sayıda örnek varsa, varsayılan olarak 10 ve görüntülenen maksimum örnek sayısı olarak 100’e kadar olan açılır menüyü seçerek sayfa başına görüntülenen örnek sayısını artırın. Tüm noktalar ve bölgeler kuyruğa eklendikten sonra, tüm deneysel veri toplama parametrelerinin her denemeyle ilişkilendirildiğinden emin olun.Nokta, Bölge, El ile ve Otomatik filtrelerini kullanın. Nokta filtresine tıklayın ve parametreleri geçerli Sıraya Alınmış Örnekler listesinde görünen tüm örneklere aynı anda uygulamak için filtre düğmelerinin altındaki Tümünü seç onay kutusuna tıklayın. Ekranın sağ tarafında, bırakılan fotoğrafın altındaki açılır menüden deneysel parametreleri seçin (Şekil 4D). Bölgeler için, Izgara Taramalı DMM 10 mikron adım, yüzde 100 iletim seçeneğini seçin. Diğer tüm nokta denemeleri için, açılır menüden uygun şekilde diğer seçenekleri belirleyin. Salınım veri koleksiyonları için, tek bir örnekten maksimum miktarda veri toplamak için Omega Scan DMM 60 derece yüzde 5 iletim seçeneğine tıklayın. Çok küçük kristaller veya radyasyona duyarlı numuneler için küçük rotasyonlar uygulayın ve belirli bir kristal formuyla önceki deneyimlere dayanarak iletimi değiştirin. Tüm örneklerde deneysel parametreler doğru şekilde uygulandıktan sonra, sayfanın alt kısmındaki Kuyruk Kapsayıcısı düğmesine tıklayın. Plaka kuyruğun tepesine ulaştığında, ışın hattına sunulacak, veri kümeleri toplanacak ve ardından ışın hattı içindeki numune deposuna tekrar geri dönecektir. Bir plakadan veri toplama işlemi tamamlandıktan sonra, ilgili verilere erişmek için izlenecek bir bağlantı içeren bir e-posta arayın. Örnek gruplar oluşturmaNOT: Benzer numuneleri birden fazla damla veya plaka arasında gruplandırmak için numune grupları oluşturulabilir. Bu örnek gruplardaki tüm veri kümeleri, DIALS tarafından işlendikten sonra xia2.multiplex14 ardışık düzeni kullanılarak işlenecektir. Bu, çok küçük veri dilimleri toplarken yararlı olabilir ve ligand bağlama deneyleri için sinyal-gürültüyü artırmak için de yararlı olabilir.Teklif numarasının altındaki açılır menüden Örnek Grup Yönetimi’ni seçin. Daha önce başka kullanıcılar tarafından oluşturulmuşlarsa grupların bir listesini arayın. Yeni bir grup oluşturmak için +Örnek Grup Oluştur düğmesine tıklayın. Örnek görüntüleyiciyi görmek için Örnek Grup Oluştur sayfasındaki açılır menüden bir gönderiye tıklayın (Şekil 5A). Doldurulan listeden ilgili örnekleri içeren kapsayıcıya tıklayın. Bir kap tıklandığında, plakaya genel bakışı gösteren bir grafik arayın. Tek tek damlaya tıklayarak tek tek damlalara tıklayın (Şekil 5B) veya ilgili satır, harf veya sütun numarasına tıklayarak satır veya sütunlardaki damlalara tıklayın. Tek bir grupla ilişkilendirilmiş tüm kutular seçildiğinde, Örnek Grup Adı kutusuna grup için bir ad girin ve Örnek Grubu Kaydet düğmesini tıklatın. Teklifle ilişkili önceden oluşturulmuş örnek grupların listesine dönmek için bu sayfadaki Örnek Grupları Görüntüle düğmesini tıklatın (Şekil 5C). Örnek grupları düzenlemeÖrnek Grup Yönetimi sayfasındaki grup listesinden bir örnek grubu tıklatın. Grup bilgilerinin altında görünen kapsayıcıların yanındaki +Örnek Grubu Düzenle düğmesine tıklayın (Şekil 5C). Plakaya genel bakışta vurgulanan, zaten bir numune grubuyla ilişkili olan damlaları gözlemleyin. Daha önce olduğu gibi damlalara, kuyucuklara veya sütunlara tıklayarak örnek gruba daha fazla damla ekleyin.NOT: Damlalar bir örnek grubundan çıkarılamaz. Ek damlalar eklendikten sonra, Örnek Grup Adı’nı düzenleyin ve ardından kaydedin veya Örnek Grubu Kaydet düğmesine tıklayarak kaydedin. Örnek grupların çıktılarını görselleştirme ve analiz etmeGrupla ilişkili kap veya kapların plakaya genel bakışını görüntülemek için örnek gruplar listesinden tek bir gruba tıklayın. Gruba dahil edilen damlalar bu ekranda vurgulanacaktır (Şekil 5D). Bu grupta veri toplanmışsa, kronolojik son üç multipleks işi içeren bir liste arayın. Aşağıdaki işleme sonuçlarını güncellemek için multipleks çalıştırma satırına tıklayın. Grupla ilişkili veri kümelerinin sayısını gösteren hızlı bağlantı düğmesine bakın. Tek tek veri kümesi koleksiyonlarını görüntüleyen yeni bir Veri Koleksiyonları sayfası açmak için bu düğmeye tıklayın. 3. Otomatik veri işlemeye erişim NOT: Veriler toplandıktan sonra, birkaç otomatik veri işleme işlem hattından geçirilir. Diamond’daki MX ışın hatlarında kullanılan dört standart boru hattı da ışın hattında toplanan veriler üzerinde çalıştırılır. Bunlar ‘fast_dp’, ‘xia2 kadranları’, ‘xia2 3dii’ ve ‘autoPROC’15’tir. ‘fast_dp’, kaliteyi hızlı bir şekilde değerlendirmek için hızlı bir veri azaltımı sağlayacaktır. Diğer üç işlem hattı daha fazla hesaplama süresi gerektirecek ve karşılaştırma için çeşitli farklı veri azaltma yazılım paketlerini çalıştıracaktır. Buna göre, çıktı genellikle ‘fast_dp’ çıktıdan daha yüksek kalitededir. Işın hattında toplanan veri kümeleri, tanımlanmış bir grup içindeki tüm veri kümelerini birleştirecek olan otomatik çok kristalli birleştirme yazılımı ‘xia2.multiplex’14 aracılığıyla da çalışacaktır. Şebeke taramaları şu anda otomatik olarak işlenmese de, verilerin ‘xia2.ssx’ işlem hattı kullanılarak manuel olarak işlenebileceğini unutmayın. Otomatik işleme işlem hatlarının sonuçları, aşağıdaki protokol kullanılarak ISPyB11’de bulunabilir. Veri kümelerini bulmaYukarıda açıklandığı gibi ISPyB’de oturum açın ve Teklifler’i seçin. Teklif numarasını arama çubuğuna kaydırarak veya yazarak ilgilendiğiniz teklifi arayın. Söz konusu ziyaretin Veri Toplamaları penceresine erişmek için ekranda görünen listeden istediğiniz ziyareti tıklatın. İstediğiniz filtreleri uygulayın.NOT: Popüler bir filtre, yalnızca bir veya daha fazla işlem hattında başarıyla çalışan veri kümelerini görüntüleyen ‘Otomatik Tümleşik’ filtresidir. Bu, şu anda ISPyB aracılığıyla otomatik olarak işlenmediği için şebeke taramalarını hariç tutacaktır. İlgilendiğiniz veri kümesini bulmak için sayfayı aşağı kaydırın.NOT: Her veri kümesi, veri kalitesinin hızlı bir şekilde gözlemlenmesi için örnek kimliğini, kullanılan deneysel parametreleri, bir kırınım resim görüntüleyicisini, bir kristal resim görüntüleyiciyi ve görüntü başına analiz grafiğini görüntüler. Otomatik işleme sonuçlarına erişmek içinOtomatik veri azaltmanın sonuçlarını incelemek için belirli bir denemenin veri özetinin altındaki Otomatik İşleme sekmesini tıklatın (Şekil 6A). Her çıktının ayrıntılı bir özetini görmek için farklı işlem hatlarına karşılık gelen farklı sekmelere tıklayın.NOT: Örnek gruplar tanımlanmışsa, multipleks işlere karşılık gelen iki sekme olacaktır. Biri, o noktaya kadar gruptaki tüm veri kümelerinin birleştirilmesine karşılık gelirken, diğeri yalnızca o damla içindeki veri kümelerinin birleştirilmesine karşılık gelir. İşlem başarılı olduysa ortaya çıkan .mtz dosyalarını ve ilişkili günlük dosyalarını indirmek için Günlükler ve Dosyalar düğmesine tıklayın. DIMPLE’dan gelen çıktıyı görüntülemek için Otomatik İşleme bölümünün altındaki Aşağı Akış İşleme sekmesine tıklayın.NOT: DIMPLE yalnızca örnek gönderimi sırasında bir PDB dosyası sağlanmışsa çalışır. DIMPLE’dan elde edilen herhangi bir çıktıyı indirmek için Günlükler ve Dosyalar düğmesine tıklayın. Grup multipleks sonuçlarına ulaşmak için ekranın üst kısmında yer alan ve üzerinde teklif numarası yazan açılır menüyü açın ve Örnek Grup Yönetimi’ne tıklayın. Doğru kap içinde istenen gruba karşılık gelen satıra tıklayın. Plakanın bir diyagramı ile görsel olarak temsil edilen gruba karşılık gelen multipleks çıkışların listesini bulmak için aşağı kaydırın.Verilen listeden istediğiniz multipleks çıktıya tıklayın. xxx Veri Kümeleri düğmesine tıklayın, burada xxx birleştirilmiş veri kümelerinin sayısıdır (Şekil 6B).NOT: Bu, Veri Koleksiyonları ekranını açar, ancak yalnızca seçilen multipleks işindeki veri kümeleri gösterilir. En üstteki denemenin Otomatik İşleme sekmesine tıklayın. Doğru sayıda birleştirilmiş veri kümesine karşılık gelen Multiplex Processing sekmesine tıklayın. .mtz ve ilgili günlük dosyalarını indirmek için Günlükler ve Dosyalar düğmesine tıklayın (adım 3.2.3’te olduğu gibi). Izgara tarama sonuçlarına erişmek içinİstediğiniz ziyaret için Veri Koleksiyonları ekranına gidin. Izgara tarama verileri sonuçları, toplanan tüm döndürme verileriyle birlikte görüntülenecektir.NOT: Otomatik işleme sonucu olmayacaktır. Kristal damlasının görüntüsü, kırınımın varlığını temsil eden bir ısı haritası ile kaplanmış ızgaraya sahip olacaktır. Izgarada o konumun kırınım görüntüsünü görüntülemek için bir kareye tıklayın. Isı haritasının neyi temsil ettiğini değiştirmek için kristal kuyu görüntüsünün üst kısmındaki açılır menüyü tıklayın. Varsayılan, kırınımın toplam yoğunluğudur, ancak toplam noktalar, tahmini çözünürlük veya buzsuz kareler olarak değiştirilebilir. 4. Verilerin yeniden işlenmesi NOT: Seçilen veri kümeleri, kullanıcı tarafından tanımlandığı şekilde değiştirilmiş ayarlarla otomatik olarak çalıştırılan aynı işlem hatları kullanılarak ISPyB11 arabirimi aracılığıyla yeniden işlenebilir. Bir çözünürlük kesme uygulanabilir; Kristalin simetrisi/hücresi biliniyorsa, işleme boru hatlarının doğru ayarda çalışmasını sağlamak için bu da tanımlanabilir. Belirli veri kümelerindeki belirli görüntü aralıkları, mevcut çok kristalli işlem hatları kullanılarak da birleştirilebilir. Sistematik radyasyon hasarı, kırınım görüntülerinin ikinci kısmının düşük kalitede olmasına neden oluyorsa, bu avantajlı olabilir. Ayrıca, kullanıcının yukarıda açıklanan protokolü kullanarak veri kümelerini indirmesi ve istediği yeniden işleme yazılımını yerel olarak çalıştırması için bir seçenektir, öğreticiler başka bir yerde ücretsiz olarak mevcuttur (https://dials.github.io/documentation/tutorials/index.html# ). Birden çok ayrı veri kümesini yeniden işlemek içinISPyB’de oturum açın ve ilgilendiğiniz veri kümelerine gidin (adım 3.1). Bir veri kümesine tıklayın ve yeniden işleme penceresini açmak için veri kümesi başlık çubuğundaki (Şekil 6) dişli çark simgesine tıklayın. İstediğiniz ayarları yapılandırın ve yeniden işlemeye hangi çerçevelerin dahil edileceğini seçin.NOT: Görüntü aralığı, etiketli kutulara bir aralık yazılarak veya görüntü başına analiz grafiğinde istenen bölgeye tıklanıp sürüklenerek tanımlanabilir (Şekil 7A). İSTEĞE BAĞLI: Tek tek yeniden işleme için başka bir veri kümesi eklemek için, dişli çark simgesine tıklayın ve ilk veri kümesinin altındaki yeniden işleme penceresinde görünecektir. işaretleyin Ayrı Ayrı İşlem Yap kutu. Integrate ( Tümleştir ) düğmesine tıklayın. Çok kristalli verileri yeniden işlemek içinHerhangi bir veri kümesinden yeniden işleme penceresini açın. Yeni bir ekran açmak için Multi-Crystal düğmesine tıklayın. Ziyaret sırasında yapılan deneylerden elde edilen bir dizi görüntü başına analiz grafiği bulmak için aşağı kaydırın. Açılan menüden bir işleme işlem hattı seçin. İSTEĞE BAĞLI: Herhangi bir çözünürlük sınırını veya bilinen birim hücre parametresini tanımlayın. Çok kristalli yeniden işlemeye dahil edilecek görüntü aralıklarını tanımlamak için tıklayın ve sürükleyin (Şekil 7).NOT: Bu, birden çok farklı kristalden gelen veri kümelerinin birleştirilmesi için birden çok farklı çizim üzerinde yapılmalıdır. Tümleştir düğmesine tıklayın (Şekil 7B). Yeniden işlenen verilere erişmek içinBelirli bir ziyaret için Veri Koleksiyonları sayfasına gidin (3.1.1-3.1.3 adımları). Ekranın üst kısmındaki Yeniden İşleme düğmesine tıklayın. İstediğiniz işi bulmak için aşağı kaydırın. Yeniden işlenen veriler için Veri Koleksiyonları ekranını açmak için sağ sütundaki dosya yoluna tıklayın. Otomatik İşleme sekmesini açın ve daha önce açıklandığı gibi verileri indirin (adım 3.2).NOT: Yeniden işlenen tüm işler, işlem hattı adının yanındaki dairesel ok simgesiyle tanımlanabilir.

Representative Results

Kristalizasyon tesisi ve VMXi ışın hattı, çok çeşitli proje türleri ve kullanım durumları için kullanılmıştır. Aşağıda, kullanıcıların neleri takip etmek isteyebileceklerini göstermek için az sayıda örnek verilmiştir. Örnek olay incelemesi 1: Standart veri toplama Işın hattı, bir kristalizasyon plakası içindeki az sayıda kristalden oda sıcaklığındaki kristal yapıların hızlı bir şekilde belirlenmesini sağlar. Minimum kristal sayısı, uzay grubuna ve kristal yönelimlerine bağlıdır, ancak genellikle 1-4’tür, ancak onlarca kristalden gelen verilerin birleştirilmesiyle gelişmiş veri kalitesi elde edilebilir. Yakın tarihli bir örnek, ışın hattı standartlarından biri olan thaumatin’dir. Şekil 8A’da gösterilen çoklu kristaller, protokol bölüm 2.3’te açıklandığı gibi manuel olarak veri toplama için işaretlendi. Bu kristaller, protokol bölüm 2.4’te açıklandığı gibi kuyruğa eklendi ve açılır listeden deneysel parametreler seçildi. Deneysel parametreler uygulandıktan sonra, plaka veri toplama için sıraya alındı. Veri kümeleri, protokol bölüm 3’te açıklandığı gibi xia2.multiplex ardışık düzeni kullanılarak toplandı, otomatik olarak ölçeklendirildi ve birleştirildi. SynchWeb’den örnek bir çıktı Şekil 8A’da ortada gösterilmiştir. Beş birleştirilmiş veri kümesi, 1.66 şçözünürlüklü bir veri kümesine yol açtı. Bir kuyuda yaklaşık beş kristalin standart veri toplanması için, veri kümeleri 2,5 dakika içinde toplanmıştır. Vaka çalışması 2: Ligand Bağlama – Mac1 proteini kullanılarak fragman deneyi Oda sıcaklığında protein-ligand komplekslerinin yapılarının üretilmesi, ışın hattı kullanılarak doğrudan gerçekleştirilebilir. Ligandlar, kristalizasyon plakaları üzerindeki damlalara (manuel olarak veya akustik damla enjeksiyonu ile) eklenebilir ve uygun bir inkübasyon süresinden sonra ölçülen veriler. Burada açıklanan örnekte, bir kristalizasyon plakasında nsp3 (Mac-1) proteininin SARS-CoV-2 ilk makro alanının kristallerini içeren kuyucuklara bir dizi parça dağıtıldı. Aynı parçayı içeren kuyulardan ikisi, protokol adımı 2.5’te açıklandığı gibi bir grup olarak atandı. Protokol adımları 2.3 ve 2.4’te açıklandığı gibi veri toplama için çoklu kristaller (42) işaretlendi ve veri kümeleri standart parametreler (60° döndürme, 0.1° adım, 0.00178 s maruz kalma, %5 iletim, kristal başına 16 KeV) kullanılarak toplandı (Şekil 8B). İki kuyudan gelen veri kümeleri, xia2.dials boru hattı kullanılarak otomatik olarak işlendi ve daha sonra, bu veri setlerinin 22’sini otomatik olarak birleştirmek için xia2.multiplex boru hattı başlatıldı. DIMPLE daha sonra bu boru hatlarının çıktısı üzerinde çalıştırıldı ve bağlı parçanın kanıtlarını açıkça gösteren haritalar verdi. Parça modeli, boş yoğunluğa yerleştirildi ve daha da rafine edildi (Şekil 8B , sağ). Oda sıcaklığındaki ligand-bağlı yapılar, yapıya dayalı ilaç tasarım sürecine paha biçilmez bilgi ve geri bildirim sağlamak için bu adım dizisi kullanılarak kolayca belirlenebilir. Bir dizi kuyuda 42 kristalin bu veri toplanması için, veri kümeleri 10 dakika içinde toplandı. Vaka çalışması 3: Düşük simetrili uzay grubu ve tercih edilen oryantasyonlara sahip yapı çözümü Plaka benzeri morfolojiye sahip çoklu kristallerden oluşan bir yığın, c-tipi gaz bağlayıcı sitokrom ile kristalizasyon deneylerinden üretildi (Şekil 8C). X-ışını ışınında sadece tek bir kristalin bulunduğu yığının kenarı etrafında birkaç konum seçerek, bir monoklinik (C2) uzay grubuna rağmen, dört kristalden takozları birleştirerek 1.75 şçözünürlüğe kadar kaliteli bir veri seti elde etmek mümkün oldu. Bu, kristalleşme koşullarını daha da optimize etmeye gerek kalmadan projenin hızlı bir şekilde ilerlemesine izin verdi. Bu sonuç daha önce9. Bir kuyudaki dört kristalin bu veri toplanması için veri kümeleri 2 dakika içinde toplandı. Vaka çalışması 4: Seri kristalografi kullanarak bir plakadaki mikro kristallerden bilgi ve oda sıcaklığı yapısı elde etme Genellikle mikrokristaller bir damla halinde göründüğünde veya kullanıcılar senkrotron veya XFEL kaynaklarında seri kristalografi deneylerinin öncüsü olarak toplu olarak mikro-kristalizasyon protokollerini optimize etmeye çalıştıklarında, minimum malzeme kullanarak farklı denemelerin kırınım özellikleri ve birim hücre boyutları hakkında hızlı geri bildirim almak çok yararlıdır. Bu kullanım durumunda, parti halinde büyüyen lizozimin mikro kristalleri bir kristalizasyon plakasına (damla başına 200 nL hacim) pipetlendi ve 10 μm adım boyutuna sahip bir ızgara taraması kullanılarak sekiz damladan toplanan veriler (Şekil 9). Elde edilen 25.906 hareketsiz görüntü, seri kristalografi yazılımı kullanılarak işlendi ve 9.891 kırınım modelinin indekslendiği ve yayınlanan oda sıcaklığı yapısına göre iyi bir şekilde rafine edilmiş 2.0 şçözünürlüğe kadar bir veri seti üretildiği bir veri seti ile sonuçlandı (Rçalışması =% 19.6, Rserbest =% 23.6 PDB 8A9D kullanılarak) (Tablo 1). Bu, birim hücre dağılımının ayrıntılı analizine ve zaman çözümlü çalışmalar da dahil olmak üzere karmaşık seri kristalografi deneylerini besleyebilecek bir mikrokristal oda sıcaklığı yapısının belirlenmesine izin verdi. Gerekli toplam mikrokristal süspansiyon hacmi 1.6 μL idi. Izgara taramaları kullanılarak sekiz kuyudaki mikrokristallerin bu veri toplanması için, veri kümeleri 40 dakika içinde toplandı. Şekil 1: Kristalizasyon taraması, kristalizasyon tesisinde optimizasyon, VMXi’de numune toplama olmadan oda sıcaklığında otomatik veri toplama ve işleme, XChem parça taraması ve diğer MX ışın hatlarında veri toplamayı entegre eden proteinden yapıya boru hattının şeması. Kullanıcılar, bir numune sağlayarak veya VMXi ışın hattına plakalar getirerek boru hattını başlatabilir. Kısaltma: Çok Yönlü Makromoleküler Kristalografi in situ. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Kristalizasyon plakalarını ayarlamak için Mosquito SPT Labtech arayüzü. (A) (1) MiTeGen In Situ-1 Kurulum görünümü. (2) 96 kuyucuklu plaka tipine giderek ve (3) MiTeGen plaka 2 damla plakasını seçerek MiTeGen 2 damla standart plakasını seçin. VMXi için gerekli olan drop 1 ve drop 2 tanım parametrelerini değiştirmek için (4) edit simgesine tıklayınız. Bu, (5) X ve Y ofsetlerinin gösterildiği gibi değiştirilmesi gereken yeni bir pencere (B) açar. (B) alt kuyu 2 ve (C) alt kuyu 3’ü seçin ve değerleri buna göre değiştirin. (D) CrystalQuickX Kurulum görünümü. 96 kuyucuklu plaka tipine gidip MiTeGen plaka 2 damla plakasını seçerek CrystalQuickX 2 damla standart plakasını seçin. VMXi için gerekli olan drop 1 ve drop 2 tanım parametrelerini değiştirmek için, yukarıdakiyle aynı şekilde düzenle simgesine tıklayın. Bu, (E,F) X ve Y ofsetlerinin gösterildiği gibi değiştirilmesi gereken yeni bir pencere açar. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 3: Bir VMXi gönderisinin nasıl oluşturulacağını, bir plakanın nasıl kaydedileceğini ve iletişim bilgilerinin nasıl kontrol edileceğini gösteren SynchWeb arayüzü. SynchWeb arayüzüne bilgi yüklemenin çeşitli aşamalarının ekran görüntüleri, (A) açılır menüden, (B,C) yeni bir gönderi kaydetmekten, (D) yeni bir konteyner kaydetmekten, (E) plaka bilgilerini girmekten, (F) iletişim bilgilerini kontrol etmekten ve (G) bir teklif içindeki kayıtlı konteynerlerin bir listesinden gösterilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 4: SynchWeb kullanarak veri toplama için örneklerin seçilmesi ve hazırlanması. SynchWeb arayüzünü kullanarak veri toplama için numune hazırlamanın çeşitli aşamalarını gösteren bir dizi ekran görüntüsü görüntülenir. (A) İlgi çekici noktalar ve bölgeler, damla genel görünümünden seçilir. Bu panelin alt kısmında, bir damlanın kronolojik bir dizi fotoğrafı var. (B) ‘Kristal’ kategorisi için sonuçları vurgulayan bir plaka için CHiMP çıktısına bir örnek. (C) Seçilen noktalar ve bölgeler listesinden kuyruğa örnekler eklemek ve (D) ışın hattı tarafından oluşturulan deney ayarlarının açılır listesinden kuyruğa alınan örneklere veri toplama için parametreler uygulamak. Deneysel parametreleri olmayan (kırmızı renkte) numuneler ile doğru uygulanmış parametrelere sahip olanlar (üst ve alt) arasındaki farka dikkat edin. Bu panelin alt kısmında, ışın hattında toplanacak plakayı sıraya koyan Queue Container butonu bulunur. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 5: SynchWeb’de örnek grup oluşturma. Örnek gruplar oluşturmanın çeşitli aşamalarını gösteren bir dizi ekran görüntüsü. (A) Numuneleri içeren plaka(lar) ilgili sevkiyattan seçilir ve (B) plaka içindeki damlalar seçilir. Bunlar tek tek damlalar olabilir veya satır ve/veya sütuna göre seçilebilir. (C) Daha önce oluşturulmuş örnek grupların bir listesi. (D) Son üç multipleks işleme işinin çıktıları listelenir ve işleme boru hattından gelen istatistikleri göstermek için seçilebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 6: Veri işleme ve veri azaltma. (A) ISPyB11’de işlenmiş bir veri kümesinin ekran görüntüsü. Yeniden işleme özelliklerine erişme düğmesi vurgulanır. Örnek kimliği ve deneysel parametreler sol üstte, kırınım resim görüntüleyicisi ise ortada gösterilir. Bu resme tıklamak, farklı resimleri incelemek için etkileşimli bir pencere açacaktır. Kristal görüntü görüntüleyici sağda gösterilir ve bu görüntüye tıklandığında ışın hattı ve Formulatrix depolama görüntülerini karşılaştırmak için etkileşimli bir pencere açılır. Görüntü başına analiz grafiği en sağda gösterilir ve bu resme tıklandığında bu çıktının büyütülmüş bir sürümü açılır. Otomatik İşleme sekmesine tıklamak, otomatik işlemeyi görünür hale getirecek ve farklı işlem hatlarının sonuçları arasındaki karşılaştırmayı kolaylaştıracaktır. Farklı işleme işlem hatları arasında geçiş yapmak ve seçilen işlem hattının ayrıntılı çıkışını görüntülemek için sekmelere tıklayın. Veri indirme için Günlükler ve Dosyalar düğmesi vurgulanır. Aşağı Akış İşleme sekmesine tıklandığında genişler ve uygun olduğunda veri sonrası azaltma işlem hatları aracılığıyla çalıştırılan tüm veri kümeleri için sonuçlar sağlanır. (B) Ekran görüntüsü Örnek Grup Yönetimi ekran. Kullanıcı tanımlı grup adı en üsttedir ve dahil edilen kuyuların görsel açıklaması aşağıda görülebilir. Yeşil bir kuyu, o damladan ölçülen tüm kristallerin gruba dahil edileceğini gösterir. Bu grup üzerinde gerçekleştirilen farklı multipleks işlerin bir özeti görülebilir ve altında multipleksin ayrıntılı çıktısı bulunur. Dahil edilen deneyleri incelemek için Veri Kümeleri düğmesi vurgulanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 7: Veri yeniden işleme pencereleri. (A) Bireysel ve (B) çok kristalli veri kümeleri. Veri bölgelerinin seçildiği iki ayrı veri kümesi görüntülenir. Tek tek işle onay kutusu işaretliyken, seçilen kırınım görüntüleri Entegre Et düğmesine basılarak tek tek işlenecektir. Çoklu kristal düğmesine tıklamak, tek tek veri kümelerinin bir görüntüsünü açacaktır. Birden çok veri kümesinden kırınım görüntülerini yeniden işlemek için, görüntülerin bölgeleri görüntülendiği gibi seçilir ve vurgulandığı gibi Entegre Et düğmesine tıklanarak yeniden işleme başlatılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 8: VMXi boru hattından elde edilen temsili sonuçlar. (A) Bir kristalleşme damlası (sol panel), veri işleme sonuçları (orta panel) ve elektron yoğunluğu (sağ panel) içinde protein taumatin için işaretlenmiş kristaller. (B) Parçanın SARS-CoV-2 Makro alanına bağlanmasını belirlemek için birden fazla kristal üzerinde toplama. Veri setleri, standart deneysel ayarlar kullanılarak EU-OPENSCREEN parça ekranından bir parça varlığında birden fazla kristal üzerinde toplandı. Bu veri koleksiyonlarının örnekleri SynchWeb’den alınan bu alıntıda gösterilmektedir. Parça, karşılık gelen yoğunluğa yerleştirildi ve en sağda gösterildiği gibi daha da rafine edildi. (C) Veri toplama için kullanılan zorlu bir kristalleşme vuruşundan bir yığın halinde işaretlenmiş monoklinik kristaller. Yeşil çarpı işaretleri ve kırmızı sayılar, verilerin 10 μm ışın ve 60° dönüş kullanılarak nerede ölçüldüğünü gösterir. Ortaya çıkan takozlardan dördü, 1.75 şçözünürlükte bir veri kümesi oluşturmak için birleştirildi. Heme grubunun etrafındaki elektron yoğunluğu sağda görüntülenir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 9: Kristalizasyon plakasındaki seri kristalografi. (A) İlgilenilen bölgeyi temsil eden beyaz bir kutu ile kristalleşme damlasının optik görüntüsü. (B) Izgara tarama noktalarının tanımı. (C) Kırınımı gösteren ısı haritası. (D) 9.000’den fazla hareketsiz kırınım modelinden elde edilen bir seri kristalografi veri setinden kaynaklanan elektron yoğunluğu haritası. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Çözünürlük (Å) Tamlık (%) Multiplicity I/σ(I) Rbölme  CC1/2  Eşsiz Gözlemler Genel 100 95.5 20.8 0.063 0.998 8422 En Düşük (55,55 – 5,43) 100 147.1 81.7 0.028 0.999 488 Yüksek (2.03 -2.00) 100 75.3 1.2 1.092 0.410 411 Tablo 1: VMXi RT seri veri kümesi için veri istatistikleri. Kısaltmalar: I = ölçekli gözlemlerin ortalama yoğunluğu; Rbölme = ölçülen yoğunlukların tutarsızlığının bir ölçüsü; CC 1/2 = veri kümesinin iki rastgele yarısı arasındaki korelasyon katsayısı.

Discussion

Bir protein örneğinin CF’ye gelmesinden, daha sonraki uygulamalar için kullanıcı tarafından nihai verilerin indirilmesine kadar olan tüm prosedürü açıkladık. Kritik adımlar, yüksek kaliteli bir protein numunesinin ve uygun kristal eleklerin üretilmesidir, ya ticari seyrek matris elekleri ya da belirlenmiş koşullara dayalı optimizasyon ekranları kullanılarak. Bu işlem CF’de gerçekleşebilir veya kullanıcılar kristalizasyon prosedürlerini ev laboratuvarlarında gerçekleştirebilir ve uygun kristalizasyon plakalarını ışın hattına getirebilir. Uygun veri toplama parametrelerinin belirlenmesi, özellikle radyasyon hasarının söz konusu olduğu durumlarda, belirli numuneler için önemli olabilir. Çoğu durumda, otomatik veri işleme, bilimsel soruyu yanıtlamak için tamamen yeterlidir, ancak kullanıcılar, örneğin uzay grubunun belirsiz olduğu veya radyasyon hasarı etkilerini en aza indirmek için toplanan verilerin yalnızca ilk kısmının kullanıldığı ışın hattı araçlarını kullanarak yeniden işleme yeteneğini korur.

İlk kristalizasyon denemelerinden uygun kristaller üretilmezse, kristal tohumlama kullanımı gibi protein konsantrasyonu, saflık veya kristalizasyon ekranlarındaki değişiklikler araştırılabilir. Kristaller ışın hattında yararlı bir çözünürlüğe kırılmazsa, optimizasyon çabalarına rehberlik etmek için kristallerin doğal kırınım sınırını ve birim hücresini değerlendirmek için zayıflatılmamış bir ışınla ızgara taramaları kullanılabilir. Plakalar içinde veri toplama için çok küçük olan kristaller (örneğin, <10 μm) bunun yerine seri kristalografi veya nano odak deneyleri için uygun olabilir (örneğin, Diamond beamline VMXm'de). VMXi verilerini kullanarak yapıları çözmek, özellikle etkili arama modelleri sağlamak için Alphafold16’nın ortaya çıkmasından bu yana, moleküler değiştirme ile genellikle basittir. Bu başarılı olmazsa, geleneksel tek dalga boylu anormal kırınım, çok dalga boylu anormal kırınım veya uzun dalga boylu faz deneylerini mümkün kılmak için kristaller plakalardan toplanabilir ve kriyo soğutulabilir.

Bu yöntemin avantajları arasında, kristalleri büyüdükleri ortamlardan rahatsız etmeye gerek kalmadan doğrudan kristalizasyon plakalarından hızlı, yüksek kaliteli veri kümeleri ve geri bildirim elde etme yeteneği yer alır. Yapısal biyolojide ‘oda sıcaklığı Rönesansı’ olarak adlandırılan, daha fazla fizyolojik alaka ve protein dinamiğinin araştırılmasını sağlamak için kriyojenik olmayan koşullar altında elde edilen yapılara prim verir2. Genellikle, optimize edilmiş bir kriyo soğutmalı kristalden biraz daha düşük bir çözünürlük elde edilir, ancak yalnızca uygun kriyo koşulları oluşturulduğunda ve kristaller mekanik işleme ve kristalleşme damlasınınaçılmasına karşı sağlamsa 3. Bu boru hattının çok uygun olduğu gelecekteki bir uygulama, ilaç keşfinde oda sıcaklığında protein-ligand komplekslerinin veya fragman kampanyalarının büyük ölçekli bir taramasıdır. Ligandlar veya fragmanlar, oda sıcaklığında veri toplanmadan önce pipet veya akustik damla püskürtme ile birlikte kristalleştirilebilir veya eklenebilir. Diğer bir uygulama, yüzlerce veya binlerce kristalden gelen verileri yüksek verimli bir şekilde hızlı bir şekilde ölçmek ve daha sonra farklı biyolojik varlıkları temsil edebilecek izomorf kümeleri çıkarmak veya farklı bir şekilde işlenmiş veya farklı ligandlara veya sinyallere maruz kalmış kristal popülasyonları arasında istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar oluşturmak için DIALS17 multipleks14 yazılımını kullanmaktır.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

VMXi ışın hattının tasarımına, yapımına ve işletilmesine katkıda bulunan birçok Elmas Işık Kaynağı bilim insanına ve destek ekibi üyesine teşekkür ederiz. Daha sonra kristalizasyon ve veri toplama boru hatlarının geliştirilmesine katkıda bulunan beamline kullanıcılarına minnettarız. Harwell’deki Kristalizasyon Tesisi, Diamond Light Source Ltd, Rosalind Franklin Enstitüsü ve Tıbbi Araştırma Konseyi tarafından desteklenmektedir.

Materials

Formulator Formulatrix on request Liquid handling robot
Formulatrix imager Formulatrix on request Crystallisation plate imager
Greiner CrystalQuick X  Greiner Z617644 Crystallisation plate
Gryphon  Art Robbins Instruments 620-1000-10  Crystalisation robot
MiTeGen Insitu-1 Mitegen InSitu-01CL-40 Crystallisation plate
Mosquito LCP  (SPT Labtech) on request Crystallisation robot
Rock Imager & Maker Formualtrix on request Software for Imager
[1] https://formulatrix.com/protein-crystallization-systems/rock-maker-crystallization-software/
Scorpion Art Robbins Instruments 640-1000-10  Liquid handling robot
https://www.artrobbins.com/scorpion
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Lynch, M. L., Snell, M. E., Potter, S. A., Snell, E. H., Bowman, S. E. J. 20 years of crystal hits: Progress and promise in ultrahigh-throughput crystallization screening. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 3), 198-205 (2023).
  2. Fischer, M. Macromolecular room temperature crystallography. Quarterly Reviews of Biophysics. 54, 1 (2021).
  3. Helliwell, J. R. What is the structural chemistry of the living organism at its temperature and pressure. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 76 (Pt 2), 87-93 (2020).
  4. Thorne, R. E. Determining biomolecular structures near room temperature using x-ray crystallography: Concepts, methods and future optimization. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 79 (Pt 1), 78-94 (2023).
  5. Keedy, D. A., et al. Crystal cryocooling distorts conformational heterogeneity in a model michaelis complex of dhfr. Structure. 22 (6), 899-910 (2014).
  6. Huang, C. Y., et al. Probing ligand binding of endothiapepsin by ‘temperature-resolved’ macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 8), 964-974 (2022).
  7. Sanchez-Weatherby, J., et al. Vmxi: A fully automated, fully remote, high-flux in situ macromolecular crystallography beamline. Journal of Synchrotron Radiation. 26 (Pt 1), 291-301 (2019).
  8. Jacquamet, L., et al. Automated analysis of vapor diffusion crystallization drops with an x-ray beam. Structure. 12 (7), 1219-1225 (2004).
  9. Mikolajek, H., et al. Protein-to-structure pipeline for ambient-temperature in situ crystallography at vmxi. IUCrJ. 10, 420-429 (2023).
  10. Douangamath, A., et al. Achieving efficient fragment screening at xchem facility at diamond light source. Journal of Visualised Experiments. (171), (2021).
  11. Delageniere, S., et al. Ispyb: An information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
  12. Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., Mcauley, K. E. Synchweb: A modern interface for ispyb. Journal of Applied Crystallography. 48 (Pt 3), 927-932 (2015).
  13. Jenkins, J., Cook, M. Mosquito®: An accurate nanoliter dispensing technology. JALA: Journal of the Association for Laboratory Automation. 9 (4), 257-261 (2016).
  14. Gildea, R. J., et al. Xia2.Multiplex: A multi-crystal data-analysis pipeline. Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 78 (Pt 6), 752-769 (2022).
  15. Winter, G., Mcauley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
  16. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with alphafold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  17. Winter, G., et al. Dials as a toolkit. Protein Science. 31 (1), 232-250 (2022).

Tags

CrystallizationIn Situ Room Temperature Data CollectionHarwell Crystallization FacilityDiamond Light Source Beamline VMXiProtein Structure DeterminationCryo-free Data CollectionSerial CrystallographyDrug DevelopmentFragment ScreeningRobotic Protein CrystallizationMachine LearningQueue-based Data CollectionData MergingStructural Biology

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Sandy, J., Mikolajek, H., Thompson, A. J., Sanchez-Weatherby, J., Hough, M. A. Crystallization and In Situ Room Temperature Data Collection Using the Crystallization Facility at Harwell and Beamline VMXi, Diamond Light Source. J. Vis. Exp. (205), e65964, doi:10.3791/65964 (2024).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image