Snabb och effektiv anrikning av musens ryggmärgsmikroglia
Summary
Mikroglia anses vara några av de mest mångsidiga cellerna i kroppen, kapabla till morfologisk och funktionell anpassning. Deras heterogenitet och multifunktionalitet gör det möjligt att upprätthålla hjärnans homeostas, samtidigt som de är kopplade till olika neurologiska patologier. Här beskrivs en teknik för rening av ryggmärgsmikroglia.
Abstract
Ryggraden definierar ett ryggradsdjur och formar ryggmärgskanalen, ett hålrum som omsluter och skyddar ryggmärgen. Korrekt utveckling och funktion av däggdjurens centrala nervsystem är i hög grad beroende av aktiviteten hos makrofager som kallas mikroglia. Mikroglia uppvisar heterogenitet och multifunktionalitet, vilket möjliggör distinkt genuttryck och beteende i ryggmärgen och hjärnan. Många studier har undersökt hjärnans mikroglias funktion och detaljerat beskrivit reningsmetoder i stor utsträckning. Reningen av mikroglia från ryggmärgen hos möss saknar dock en heltäckande beskrivning. Däremot saknar användningen av ett högrenat kollagenas, i motsats till ett oraffinerat extrakt, rapportering inom centrala nervsystemets vävnader. I denna studie avlägsnades kotpelaren och ryggmärgen från 8-10 veckor gamla C57BL/6-möss. Efterföljande nedbrytning använde ett högrenat kollagenas, och mikroglia-rening använde en densitetsgradient. Cellerna genomgick färgning för flödescytometri och bedömde viabilitet och renhet genom CD11b- och CD45-färgning. Resultaten gav en genomsnittlig viabilitet på 80 % och en genomsnittlig renhet på 95 %. Sammanfattningsvis involverade manipulation av mikroglia hos möss matsmältning med ett högrenat kollagenas, följt av en densitetsgradient. Detta tillvägagångssätt gav effektivt upphov till betydande populationer av ryggmärgsmikroglia.
Introduction
Det utmärkande kännetecknet för ryggradsdjur är ryggraden, där notokordet har ersatts av en sekvens av segmenterade ben som kallas ryggkotor, åtskilda av intervertebrala skivor. Denna följd av benmaterial formar ryggmärgskanalen, ett hålrum som omsluter och skyddar ryggmärgen. I släktet Rodentia bildas ryggraden vanligen av sju halskotor, tretton bröstkotor, sex ländkotor och ett varierande antal svanskotor 2,3. Ryggmärgens längd liknar ryggradens, och terminalfilum är en icke-nervös struktur som förankrar ryggmärgen till korsbenet. Dessutom går nervfibrer ut genom den intervertebrala foramen1.
Utvecklingen och funktionen av det centrala nervsystemet hos däggdjur beror i hög grad på aktiviteten hos nervsystemets inneboende makrofager, kallade mikroglia4. Även om mikroglia ursprungligen beskrevs som fagocyter som är bosatta i hjärnan, har ny forskning tillskrivit dessa celler många dynamiska funktioner 5,6. Microglias storlek varierar från 7 till 10 μm i homeostas; De anses vara bland de mest mångsidiga cellerna i kroppen och kan anpassa sig morfologiskt och funktionellt till sin ständigt föränderliga miljö7. Dessa celler uppvisar hög heterogenitet under både det embryonala och det vuxna stadiet8,9, medan de i vuxenstadiet också uppvisar komplex funktionell heterogenitet baserat på deras spatiotemporala sammanhang10. Mikroglias heterogenitet och multipla funktioner möjliggör differentiellt genuttryck och beteende i ryggmärgen och hjärnan. Det har visat sig att CD11b, CD45, CD86 och CCR9 uttrycks högre i ryggmärgen jämfört med hjärnan 8,9.
Det finns flera protokoll för isolering av cerebrala mikroglia11,12; Det finns dock bara ett fåtal för ryggmärgsmikroglia13,14. Att optimera en metod för att rena mikroglia från ryggmärgen underlättar utvecklingen av flera studier med fokus på att upptäcka mikroglias fysiologi. Detta protokoll syftar till att beskriva en enkel och mycket reproducerbar extraktion av ryggmärgen hos möss och rening av mikroglia (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Många protokoll har utvecklats för studier av mikroglia på grund av deras betydelse för hjärnans homeostas. I dessa metoder kommer mikroglia vanligtvis från hjärnhalvorna hos embryonala eller neonatala råttor och möss17. Ett begränsat antal studier har behandlat rening av mikroglia från ryggmärgen hos vuxna möss13,14. Dessa tekniker involverar enzymatisk nedbrytning med kollagenas och/eller papain tillsammans med DNAse, ofta i…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från det stipendium som beviljats av National Council of Science and Technology (CONACYT) (702361). Författarna erkänner Ph.D. programmet i biologiska kemiska vetenskaper vid National School of Biological Sciences vid National Polytechnic Institute.
Materials
| 15 mL collection tubes | Corning, USA | 430790 | |
| 2 mL microtubes | Axygen, USA | MCT-200-G | |
| 2.4G2 anti-FcR | BioLegend, USA | 101302 | |
| 50 mL collection tubes | Corning, USA | 430829 | |
| 70% ethanol | |||
| Antibiotic-Antimycotic (penicillin, streptomycin, amphotericin b) | Gibco, USA | 15240062 | |
| Antibody CD11b eFluor 450 anti-mouse | eBioscience, USA | 48-0112 | |
| Antibody CD45 PerCP anti-mouse | BioLegend, USA | 103130 | |
| Balanced salt solution (PBS) calcium- magnesium-free | Corning, USA | 46-013-CM | |
| Blue Cell Strainer 40 μm | Corning, USA | 352340 | |
| Costar 6-well Clear Not Treated | Corning, USA | CLS3736 | |
| Coverslips | |||
| Digital Heating Shaking Drybath | Thermo Scientific Digital HS Drybath, USA | 88870001 | |
| Dissecting forceps for microsurgery | FT by DUMONT | ||
| DNase | Roche, USA | 4536282001 | |
| Dulbecco´s Modified Eagle´s Medium-high glucose (DMEM) | Merck, USA | D6429 | |
| Electric shaver | |||
| FACS tube | Thermo, USA | 352058 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | PAN Biotech, Alemania | P30-3306 | |
| Flow cytometer Cytoflex | Beckman Coulter | ||
| Hank’s balanced salt solution | Merck, USA | H2387 | |
| L-glutamine | Corning, USA | 15393631 | |
| Liberase TM | Roche, USA | 5401119001 | |
| Neubauer chamber Counting Chambers | China | 1103 | |
| Pentobarbital | |||
| Percoll | Merck, USA | 17089101 | density gradient centrifugation |
| Poly-L-lysine solution | Merck, USA | P8920 | |
| Scalpel No. 25 | HERGOM, Mexico | H23 | |
| Snaplock Microcentrifuge Tubes 2 mL | Axygen, USA | 10011-680 | |
| Stereoscopic microscope | Velab, Mexico | HG927831 | |
| Straight surgical scissors (10 cm) | HERGOM, Mexico | ||
| Straight Vannas scissors | HERGOM, Mexico | ||
| Triton X100 | Merck, USA | X100 | |
| Trypan blue Stain 0.4% | Merck, USA | 15250-061 | |
| Vortex mixer | DLAB, China | 8031102000 | |
| Zombie Aqua Fixable Viability Kit | BioLegend, USA | 423102 | amine-reactive fluorescent dye staining |
Referencias
- Schröder, H., Schröder, , Moser, , Huggenberger, , et al. . Neuroanatomy of the Mouse. , 59-78 (2020).
- Sengul, G., et al. Cytoarchitecture of the spinal cord of the postnatal (P4) mouse. Anat Rec. 295, 837-845 (2012).
- Bab, I., et al. . Microtomographic atlas of the mouse skeleton. VIII, 205 (2007).
- Nayak, D., et al. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 32, 367-402 (2014).
- Martinez, F. O., et al. Macrophage activation and polarization. Front Biosci. 13, 453-461 (2008).
- Masuda, T., et al. Microglia heterogeneity in the single-cell era. Cell Rep. 30 (5), 1271-1281 (2020).
- Prinz, M. Microglia biology: one century of evolving concepts. Cell. 179 (2), 292-311 (2019).
- de Haas, A. H., et al. Region-specific expression of immunoregulatory proteins on microglia in the healthy CNS. Glia. 56 (8), 888-894 (2008).
- Xuan, F. L., et al. Differences of microglia in the brain and the spinal cord. Front Cell Neurosci. 13, 504 (2019).
- Paolicelli, R. Microglia states and nomenclature: A field at its crossroads. Neuron. 110 (21), 3458-3483 (2022).
- Li, Q., et al. Spinal IL-36γ/IL-36R participates in the maintenance of chronic inflammatory pain through astroglial JNK pathway. Glia. 67 (3), 438-451 (2019).
- Prinz, M., et al. Microglia and central nervous system-associated macrophages-from origin to disease modulation. Annu Rev Immunol. 39, 251-277 (2021).
- Yip, P. K., et al. Rapid isolation and culture of primary microglia from adult mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 183 (2), 223-237 (2009).
- Akhmetzyanova, E. R., et al. Severity- and time-dependent activation of microglia in spinal cord injury. Int J Mo. Sci. 24 (9), 1-16 (2023).
- Mahadevan, V. Anatomy of the vertebral column. Surgery. 36 (7), 327-332 (2018).
- Krukowski, K., et al. Temporary microglia-depletion after cosmic radiation modifies phagocytic activity and prevents cognitive deficits. Sci Rep. 8 (1), 1-13 (2018).
- Cardona, A., et al. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat Protoc. 1, 1947-1951 (2006).
- Schmidt, V. M., et al. Comparison of the enzymatic efficiency of Liberase TM and tumor dissociation enzyme: effect on the viability of cells digested from fresh and cryopreserved human ovarian cortex. Reprod Biol Endocrinol. 16 (57), 1-14 (2018).
- Kusminski, C. M., et al. MitoNEET-parkin effects in pancreatic α- and β-cells, cellular survival, and intrainsular cross talk. Diabetes. 65 (6), 1534-1555 (2016).
