מעקב אחר התנהגות חיפוש מקומי בדרוזופילה
Summary
פרוטוקול זה מתאר בדיקה התנהגותית לרישום התנהגות חיפוש המעוררת סוכר באמצעות Drosophila melanogaster. הבדיקה יכולה לשמש לחקר התנהגויות הקשורות להאכלה וליקוט מזון, כמו גם את המנגנונים העצביים הבסיסיים.
Abstract
התנהגות מזון חיונית להישרדותם של אורגניזמים מכיוון שהיא מאפשרת להם לאתר ולרכוש משאבי מזון חיוניים. בדרוזופילה, רעב מעורר התנהגות חיפוש מובחנת בעקבות צריכת כמויות קטנות של תמיסת סוכר. דו”ח זה מציג מערך ניסויי פשוט לחקר התנהגות חיפוש הנובעת מסוכר במטרה לחשוף את המנגנונים העומדים בבסיסם. כמויות זעירות של תמיסת סוכר מרוכזת מעוררות התנהגות חיפוש מתמשכת בזבובים. המעורבות של שילוב נתיב בהתנהגות זו נקבעה, שכן זבובים מנצלים את מסלולם כדי לחזור למקום הסוכר. הממצאים האחרונים מספקים עדות לאפנון זמני בהתחלת ועוצמת התנהגות החיפוש לאחר צריכת סוכר. השתמשנו במערך הזה גם להפעלה מלאכותית של נוירונים ספציפיים של קולטני טעם בלוע, מה שמעורר את התנהגות החיפוש. ערכת הכלים הנוירוגנטית Drosophila מציעה מגוון רחב של כלים וטכניקות שניתן לשלב עם פרדיגמת התנהגות החיפוש המעוררת סוכר כדי לחקור את המנגנונים העצביים והגנטיים העומדים בבסיס ליקוט מזון. הבנת הבסיס העצבי של התנהגות חיפוש מונעת רעב בזבובים תורמת לתחום הנוירוביולוגיה בכללותו, ומציעה תובנות לגבי מנגנוני הבקרה השולטים בהתנהגויות אכילה לא רק באורגניזמים אחרים אלא גם בבני אדם.
Introduction
התנהגות של חיפוש מזון וחיפוש מזון היא אסטרטגיית הישרדות בסיסית המוצגת על ידי אורגניזמים ברחבי טקסה. שני סוגים של התנהגויות ליקוט מזון זוהו בחרקים: חיפוש מזון כתוצאה מרעב וחיפוש מקומי לאחר הארוחה1. כאשר הם רעבים, חרקים מסתמכים על רמזים חושיים כדי לאתר מקורות מזון. כאשר הם נתקלים בחלקת מזון קטנה וצורכים אותה, הם יוזמים התנהגות חיפוש מקומית המאופיינת בשבילים מפותלים ובסיבוב סביב מקום המזון.
התנהגות חיפוש באמצעות סוכר, צורה מסוימת של חיפוש מקומי, נחקרה לראשונה לפני יותר מ-60 שנה, על ידי הביולוג האמריקאי וינסנט דטייה (Dethier) בספרו Blowflies2. כאשר מורעבים, זבובים מוצגים עם כמות קטנה של סוכר כך שזה לא להשביע אותם, הם מתחילים חיפוש מקומי. התנהגות חיפוש טיפוסית מאופיינת בהליכה מפותלת מאוד עם מנוע נמוך וקצב פנייה גבוה וחזרה למיקום ירידת הסוכר. מחקרים מאוחרים יותר בדקו התנהגות זו בזבובי בית וזבובי פירות 3,4. ההתחלה, האינטנסיביות ומשך החיפוש מווסתים על ידי המצב הפנימי של בעל החיים (למשל, חסך ומוטיבציה) כמו גם גורמים חיצוניים כגון זמינות משאבים ואיכות 1,5,6.
ההתקדמות בטכנולוגיות המעקב סיפקה לחוקרים כלים רבי ערך ללכוד ולנתח התנהגות בזירות מבוקרות. כאן, אנו מציגים פרדיגמה התנהגותית למעקב אחר זבובים ההולכים בחופשיות לאחר צריכת סוכר. מערך פשוט זה מאפשר לחקור את התנהגות החיפוש המופקת מסוכר בדרוזופילה על ידי לכידת וניתוח תנועת הזבוב בתגובה לתמיסת סוכר מרוכזת המסופקת בזירה. תוך שימוש בטכנולוגיות מעקב מתקדמות וטכניקות ניתוח נתונים, דפוסי התנועה, החקירה המרחבית ודינמיקת התגובה לגירויי סוכר כומתו בהצלחה.
באמצעות בדיקה זו, הוכח בניסוי כי החיפוש המופק מסוכר כרוך בשימוש בשילוב נתיבים וניתן להפריד אותו מרחבית-זמנית מצריכת סוכר 7,8. יתר על כן, הוכח כי ההתנהגות יכולה להיות מופעלת על ידי הפעלת נוירוני טעם הלוע9. תוצאות אחרונות מראות כי גירוי סוכר אינו מנגנון שחרור מולד אלא גם אפנון, ושולט על התחלת ההתנהגות באופן זמני8. באמצעות פרדיגמה זו, חקרנו את ההתנהגות הזו גם בדבורי דבש (Apis mellifera)7,8.
המטרה הסופית של מחקר זה היא לפענח מעגלים עצביים ורכיבים גנטיים חדשים המעורבים בוויסות התנהגות החיפוש באמצעות מניפולציות גנטיות ממוקדות וטכניקות דימות מוחי. התנהגויות חיפוש מזון הוכיחו את עצמן כפרדיגמות ניסוייות יעילות ביותר לחקר ניווט וזיכרון מרחבי בחרקים. התנהגויות אלה מספקות הזדמנות ייחודית לחקור את התפיסה החושית, תהליכי קבלת ההחלטות והתיאום המוטורי המעורבים בחיפוש אחר מקורות מזון מתגמלים בזבובים. בנוסף, לממצאים ממחקרים אלה יש השלכות רחבות יותר על הבנת התנהגויות אכילה באורגניזמים אחרים, כולל בני אדם, שכן מנגנונים גנטיים ועצביים בסיסיים רבים נשמרים אבולוציונית. דיסרגולציה של התנהגויות האכלה קשורה להפרעות נוירולוגיות ומטבוליות שונות10. לכן, המנגנונים העצביים והגנטיים העומדים בבסיס התנהגות החיפוש בזבובים עשויים להציע דרכים חדשות להבנה והתמודדות פוטנציאלית עם אתגרים מורכבים אלה בתחום בריאות האדם.
Protocol
Representative Results
Discussion
המחקר הנוכחי מציג פרדיגמה פשוטה לחקר התנהגות חיפוש הנובעת מסוכר בדרוזופילה, שתוארה לראשונה על ידי Dethier2. התנהגות מולדת זו מאפשרת לזבובים לעסוק בחיפוש מקומי אחר מקורות מזון נוספים בעקבות המפגש עם פרס מזון. ההיבט המכריע ביותר של פרוטוקול הניסוי כרוך בהנעת הזבובים כראוי. ראשית, הזבובים חייבים להיות במצב של רעב, לאחר שנמנע מהם מזון ועדיין יש להם גישה למים, כדי להבטיח בליעת סוכר. על מנת לקבל את מצב הרעב האחיד לאורך ניסויים ניסיוניים, משך הזמן שבו 90% מהאוכלוסייה שורדת שימש כתקופת הרעב. באופן מכריע, השראת תגובת חיפוש לאחר האכלה מחייבת מתן גירוי מזון באיכות מספקת אך לא מספיק כדי להשביע את הזבובים באופן מלא. לכן, סטנדרטיזציה של ריכוז וכמות הסוכר, ומשך הרעב עשויה לגזול זמן רב, אך היא הכרחית להתנהגות איתנה ואמינה.
במחקר זה, תמיסת סוכרוז של 500 מילימול, 0.2 מיקרוליטר שימשה כגירוי לזבובים מורעבים. צריכת סוכר מעוררת התנהגות חיפוש מקומית אופיינית המאופיינת בהתנהגות פנייה מוגברת והחזרות תכופות למיקום טיפת הסוכר (סרטון 1). לעומת זאת, זבובים רעבים שאינם מקבלים סוכר אינם מצליחים להציג תגובת חיפוש. יש לציין כי כל הפרמטרים הקשורים להתנהגות, כולל אורך נתיב, זמן שהייה, פיתול ומספר החזרות היו נמוכים משמעותית בזבובים שלא הוזנו. הוכחנו בעבר כי בליעת מים לבדה אינה מעוררת תגובת חיפוש9.
מערך זה מציע גישה חסכונית ותחזוקה נמוכה לחקר התנהגות מולדת זו. בעוד שבמחקר זה נעשה שימוש בזירה עם תאורה אחורית, ניתן להשתמש גם בתאורה עליונה כל עוד יש מספיק ניגודיות בין הזבוב לרקע. תוכנת המעקב בה נעשה שימוש מסתמכת על זיהוי תנועת זבובים על רקע סטטי13. ניתן לכוונן את הגדרות המצלמה והרזולוציה בהתבסס על קנה המידה הספציפי של ההתנהגות הנחקרת. חשוב לציין כי מתודולוגיה זו מאפשרת לחקור מרכיבים שונים של התנהגות ליקוט מזון, כולל קשב רמז חושי במהלך ליקוט מזון, מעורבות מזון והאכלה, שליטה מוטורית בחיפוש, ותהליכי קבלת החלטות הקשורים לניצול וחקירה, בין היתר. יתר על כן, פרדיגמה זו מאפשרת חקירה של חיפוש מקומי, התנהגות הנפוצה על פני טקסים מגוונים בהקשרים אקולוגיים שונים6. חקר התנהגות זו בדרוזופילה, פותח אפיקים לחקירה מדעית שמטרתה להבין את המסלולים העצביים המעורבים בליקוט מזון. חקרנו חיפוש מקומי בדבורי דבש והראינו שההתנהגות דומה לזבובים 7,8.
מחקרים אחרונים הראו כי התנהגות חיפוש מקומית יכולה להיות מופעלת על ידי הפעלה אופטוגנטית של נוירונים חושי סוכר שונים בזבובים 14,15,16. עם זאת, עדיין לא ברור באיזו מידה החיפושים המקומיים שנצפו במחקרים אלה מייצגים במדויק את ההתנהגות הטבעית של זבובים בתגובה לצריכת סוכר בפועל. התנהגות ההאכלה מווסתת היטב בזבובים, וממצאים אלה מצביעים על כך שהפעלת קולטני הסוכר בלוע יוזמת את התנהגות החיפוש. חושי טעם טרסליים אחראים על גילוי סוכר וגרימת רפלקס הארכת החוטם, בעוד נוירוני טעם הלוע קובעים אם האכלה צריכה להמשיך17,18. לאחר בליעתה, תמיסת הסוכר עוברת דרך הוושט אל הפרובנסטריקולוס ונכנסת ליבול, כאשר התפשטותה מנוטרת על ידי עצב חוזר19. בנוסף, ראוי לציין כי חלק מהמחקרים הנ”ל עסקו ברתימה או כליאה של זבובים, בעוד ששיטה זו מאפשרת לבעלי החיים ללכת בחופשיות לאורך כל הניסוי. לזבובים בניסויים שלנו הייתה מוטיבציה מספקת להישאר ולחפש בתוך הזירה ללא הטלת מכסה.
הבנת יחסי הגומלין המורכבים בין מסלולים עצביים, גורמים גנטיים ורמזים סביבתיים השולטים בהתנהגות החיפוש בזבובים יכולה לשפוך אור על העקרונות הבסיסיים של עיבוד מידע, למידה ויצירת זיכרון. יתר על כן, חוסר ויסות של התנהגות ליקוט מזון היה מעורב בהפרעות אנושיות שונות, כולל הפרעות אכילה והשמנת יתר. המערך הנרחב של כלים נוירוגנטיים הזמינים בדרוזופילה מספק משאב רב ערך לחקר התנהגות החיפוש הנובעת מסוכר ולפענוח המנגנונים העצביים והגנטיים העומדים בבסיס ליקוט מזון. בשילוב עם מניפולציה אופטוגנטית ודימות פונקציונלי, פרדיגמה זו מציגה גישה חזקה ומבטיחה20,21,22. עם זאת, שינוי ההגדרה למניפולציה בזמן אמת של פעילות עצבית עם אופטוגנטיקה עשוי להיות מאתגר. כדי לנטר את הפעילות העצבית במוח בזמן שזבוב מבצע את התנהגות החיפוש, יהיה צורך במערך אחר, כמו הזבוב הקשור על כדור דריכה. היבטים רבים של התנהגות ליקוט מזון, כגון ויסות האכלה ותהליכי קבלת החלטות, נשמרים מאוד בין מינים שונים. לכן, תובנות המתקבלות מחקירת המנגנונים העצביים של ליקוט מזון בזבובים יכולות לספק תובנות חשובות על תהליכים דומים באורגניזמים אחרים, כולל בני אדם.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לרביקומאר בויאפאטי על עזרתו בהקמת הזירה. עבודה זו ממומנת על ידי Wellcome trust DBT Intermediate India Alliance מענק (מענק מספר IA/I/15/2/502074) ל- P.K. M.S. מומן על ידי מלגה על ידי המועצה ההודית למחקר רפואי (ICMR). A.B. מומן על ידי NCBS-TIFR קרנות מוסדיות (מס ’12P4167) והמחלקה לאנרגיה אטומית, ממשלת הודו (מס ’12-R& D-TFR-5.04-0800 ו-12-R&R & D-TFR-5.04-0900).
Materials
| 2 mL Eppendorf tube | Sigma Aldrich | BR780546 | Used to introduce the fly to the sugar drop |
| Agar | SRL | 9002-18-0 | |
| Azure lens | https://www.rmaelectronics.com/azure-photonics-azure-1214mm/ | ||
| Camera | Logicool, Japan | ||
| Corn flour | locally available | ||
| Ctrax software | https://ctrax.sourceforge.net/ | ||
| D-glucose | SRL | 50-99-7 | |
| Flea3 | Sony | https://www.flir.com/products/flea3-usb3/?vertical=machine+vision&segment=iis | |
| glass tube | Borosil | Used to house the flies individually | |
| Kimwipe | Kimberly-Clark | 34155 | Used to provide access to water for flies during food starvation |
| LED light panel | custom-made in the workshop | ||
| Light Meter | TENMARS | TM-203 | |
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Fisher Scientific | 99-76-3 | |
| Orthophosphotic acid | SRL | 7664-38-2 | |
| Petri dish (90 mm) | Tarsons | 460090 | |
| Propionic acid | SRL | 79-09-4 | |
| Sucrose | Qualigens | Q28105 | |
| Sugar | locally available | ||
| VirtualDub | https://www.virtualdub.org/ | ||
| White polyvinyl chloride pipe (67 mm inner diameter × 100 mm height) | custom-made in the workshop | ||
| Yeast powder | SRL | REF-34266 |
Referencias
- Jander, R. Ecological aspects of spatial orientation. Annu Rev Ecol Evol Syst. 6 (1), 171-188 (1975).
- Dethier, V. G. Communication by insects: Physiology of dancing. Science. 125 (3243), 331-336 (1957).
- White, J., Tobin, T. R., Bell, W. J. Local search in the housefly Musca domestica after feeding on sucrose. J. Insect Physiol. 30 (6), 477-487 (1984).
- Bell, W. J., Cathy, T., Roggero, R. J., Kipp, L. R., Tobin, T. R. Sucrose stimulated searching behaviour of Drosophila melanogaster in a uniform habitat: modulation by period of deprivation. Animal Behav. 33, 436-448 (1985).
- Dethier, V. G. Microscopic Brains. Science. 143 (3611), 1138-1145 (1964).
- Bell, W. J. Searching behavior patterns in insects. Annu Rev Entomol. 35 (1), 447-467 (1990).
- Brockmann, A., et al. Sugar intake elicits intelligent searching behavior in flies and honey bees. Front Behav Neurosci. 12, 280 (2018).
- Shakeel, M., Brockmann, A. Temporal effects of sugar intake on fly local search and honey bee dance behaviour. J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. , (2023).
- Murata, S., Brockmann, A., Tanimura, T. Pharyngeal stimulation with sugar triggers local searching behavior in Drosophila. J Exp Biol. 220 (Pt 8), 3231-3237 (2017).
- Nishijo, H., Ono, T. Neural mechanisms of feeding behavior and its disorders new insights into metabolic syndrome. IntechOpen. , (2021).
- Carvalho, G. B., Kapahi, P., Anderson, D. J., Benzer, S. Allocrine modulation of feeding behavior by the sex peptide of Drosophila. Curr Biol. 16 (7), 692-696 (2006).
- Xu, K., Zheng, X., Sehgal, A. Regulation of feeding and metabolism by neuronal and peripheral clocks in Drosophila. Cell Metab. 8 (4), 289-300 (2008).
- Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Corfas, R. A., Sharma, T., Dickinson, M. H. Diverse food-sensing neurons trigger idiothetic local search in Drosophila. Curr Biol. 29 (10), 1660-1668.e4 (2019).
- Behbahani, A. H., Palmer, E. H., Corfas, R. A., Dickinson, M. H. Drosophila re-zero their path integrator at the center of a fictive food patch. Curr Biol. 31 (20), 4534-4546.e5 (2021).
- Titova, A. V., et al. Displacement experiments provide evidence for path integration in Drosophila. J Exp Biol. 226 (12), jeb245289 (2023).
- Stocker, R. F. The organization of the chemosensory system in Drosophila melanogaster: a review. Cell Tissue Res. 275 (1), 3-26 (1994).
- LeDue, E. E., Chen, Y. C., Jung, A. Y., Dahanukar, A., Gordon, M. D. Pharyngeal sense organs drive robust sugar consumption in Drosophila. Nat Commun. 6, 6667 (2015).
- Gelperin, A. Abdominal sensory neurons providing negative feedback to the feeding behavior of the blowfly. Zeitschrift für vergleichende Physiologie. 72 (1), 17-31 (1971).
- Simpson, J. H., Looger, L. L. Functional imaging and optogenetics in Drosophila. Genética. 208 (4), 1291-1309 (2018).
- DeAngelis, B. D., Zavatone-Veth, J. A., Gonzalez-Suarez, A. D., Clark, D. A. Spatiotemporally precise optogenetic activation of sensory neurons in freely walking Drosophila. Elife. 9, e54183 (2020).
- Grover, D., Katsuki, T., Li, J., Dawkins, T. J., Greenspan, R. J. Imaging brain activity during complex social behaviors in Drosophila with Flyception2. Nat Commun. 11 (1), 623 (2020).
