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Investigación sobre el cáncer

Kultivierung von ex vivo patienteneigenen Gliom-Organoiden mit einem Gewebe-Chopper

Published: January 19, 2024
doi:
10.3791/65952
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1Section Experimental Neurosurgery, Department of Neurosurgery,University Hospital Würzburg, 2Department of Neurosurgery,University Hospital Würzburg, 3Department of Hematology,University Hospital Würzburg, 4Department of Neuropathology, Institute of Pathology,University Hospital Würzburg

Summary

Diese Studie stellt eine automatisierte Methode zur Erzeugung von 3-dimensionalen Organoiden aus dem Glioblastom eines Patienten unter Verwendung eines Gewebezerkleinerers vor. Die Methode bietet einen geeigneten und effektiven Ansatz, um solche Organoide für therapeutische Tests zu erhalten.

Abstract

Das Glioblastom, IDH-Wildtyp, ZNS WHO Grad 4 (GBM) ist ein primärer Hirntumor, der trotz aggressiver Behandlung mit einem schlechten Überleben der Patienten einhergeht. Die Entwicklung realistischer Ex-vivo-Modelle bleibt eine Herausforderung. Patientenabgeleitete 3-dimensionale Organoidmodelle (PDO) bieten innovative Plattformen, die die phänotypische und molekulare Heterogenität von GBM erfassen und gleichzeitig die wichtigsten Merkmale der ursprünglichen Tumoren erhalten. Die manuelle Dissektion zur Erzeugung der g.U. ist jedoch zeitaufwändig, teuer und kann zu einer Reihe von unregelmäßigen und ungleichmäßig großen g.U. führen. Diese Studie stellt eine innovative Methode zur g.U.-Herstellung mit einem automatisierten Tissue-Zerkleinerer vor. Tumorproben von vier GBM- und einem Astrozytom-, IDH-mutierten, ZNS-WHO-Grad 2-Patienten wurden sowohl manuell als auch mit dem Gewebe-Chopper bearbeitet. Beim manuellen Ansatz wurde das Tumormaterial mit Skalpellen unter mikroskopischer Kontrolle präpariert, während der Gewebehacker in drei verschiedenen Winkeln eingesetzt wurde. Nach der Kultur auf einem orbitalen Shaker bei 37 °C wurden morphologische Veränderungen mittels Hellfeldmikroskopie bewertet, während Proliferation (Ki67) und Apoptose (CC3) nach 6 Wochen durch Immunfluoreszenz beurteilt wurden. Die Tissue-Chopper-Methode reduzierte die Herstellungszeit um fast 70 % und führte ab der zweiten Woche zu einer signifikant höheren mittleren Anzahl von PDOs im Vergleich zum manuell verarbeiteten Gewebe (Woche 2: 801 vs. 601, P = 0,018; Woche 3: 1105 vs. 771, P = 0,032; und Woche 4: 1195 vs. 784, P < 0,01). Die Qualitätsbewertung ergab ähnliche Raten der Apoptose und Proliferation von Tumorzellen für beide Herstellungsmethoden. Daher bietet die automatisierte Tissue-Chopper-Methode einen effizienteren Ansatz in Bezug auf Zeit und PDO-Ausbeute. Diese Methode ist vielversprechend für das medikamentöse oder immuntherapeutische Screening von GBM-Patienten.

Introduction

Niedriggradige Gliome (LGGs) sind eine Gruppe relativ seltener Hirntumoren, die im Vergleich zu hochgradigen Gliomen wie dem Glioblastom typischerweise langsam wachsen und weniger aggressiv sind. Sie können sowohl bei Erwachsenen als auch bei Kindern auftreten, mit einer etwas höheren Prävalenz bei Erwachsenen. Die genaue Prävalenz variiert je nach Region und Bevölkerung, aber LGGs machen etwa 15 % bis 20 % aller primären Hirntumorenaus 1. Behandlungsstrategien für LGGs beinhalten oft eine Kombination aus Operation, Strahlentherapie und Chemotherapie, um die Tumorresektion zu maximieren und gleichzeitig die neurologische Funktion zu erhalten. Die Behandlung von LGGs kann komplex sein, und die Wahl der Therapie kann von Faktoren wie Tumorlokalisation und molekularen Eigenschaften abhängen2. Fortschritte beim Verständnis der genetischen und molekularen Grundlagen von LGGs haben zu gezielteren Therapien geführt, und die laufende Forschung verfeinert weiterhin die Behandlungsansätze.

Das Glioblastom, IDH-Wildtyp, ZNS WHO Grad 4 (GBM) hingegen ist mit einer Inzidenzrate zwischen 3,19 und 4,17 Fällen pro 100.000 Personenjahre der häufigste primäre Hirntumor bei Erwachsenen3. GBM verursacht Symptome wie Kopfschmerzen, Krampfanfälle, fokale neurologische Defizite, Persönlichkeitsveränderungen und erhöhten Hirndruck. Die Standardbehandlung für GBM umfasst das Debulking des Tumors, wenn möglich, gefolgt von einer Strahlentherapie in Kombination mit Temozolomid4. Darüber hinaus kann die Kombination von Temozolomid und Lomustin die mediane Gesamtüberlebensrate bei Patienten mit O6-Methylguanin-Methyltransferase (MGMT)-Promotor-Methylierungerhöhen 5. Trotz dieser jüngsten Therapieansätze bleibt GBM jedoch eine unheilbare Krankheit mit schlechter Prognose, die durch eine mediane Gesamtüberlebensrate der Patienten von 16 Monaten bis zu 20,9 Monaten gekennzeichnet ist, wenn Tumor Treating Fields (TTFields) hinzugefügt wird 3,6. Mehrere immuntherapeutische Ansätze wurden bei GBM untersucht, zeigten jedoch eine begrenzte Wirksamkeit in vivo. Darüber hinaus behindern klinische und präklinische Einschränkungen therapeutische Durchbrüche7. Die Etablierung eines geeigneten und realistischen ex vivo-Modells war aufgrund der Inter-8– und intratumoralen9-Heterogenität von GBM eine Herausforderung.

Herkömmliche 2-dimensionale (2D) Patientenzelllinien stellen homogene Zellpopulationen dar und eignen sich für das Hochdurchsatz-Wirkstoffscreening. Von Patienten stammende und immortalisierte Zelllinien können GBM jedoch aufgrund unterschiedlicher Wachstumsbedingungen und Abweichungen in genotypischen und phänotypischen Merkmalen nach mehreren Passagen nicht angemessen nachahmen 10,11,12.

Auf der anderen Seite haben sich 3D-Organoidmodelle in letzter Zeit als vielversprechende Systeme herausgestellt, die die phänotypische und molekulare Heterogenität von Organ- und verschiedenen Krebsarten replizieren 13,14,15,16,17,18. Im Zusammenhang mit GBM wurden zerebrale Organoide genetisch verändert, um tumorähnliche Eigenschaften zu simulieren16,17 oder mit GSCs oder Sphäroiden kokultiviert, um eine Tumorzellinfiltration zu induzieren 18,19. Während von Patienten stammende GBM-Organoide, die mit Matrigel und EGF/bFGF kultiviert wurden, GBM-Merkmale wie Stammzellheterogenität und Hypoxieaufweisen 20, bleibt ungewiss, inwieweit dieses Modell die wichtigsten molekularen Eigenschaften von Patientenneoplasien darstellen kann.

Von Patienten stammende GBM-Organoide (PDOs) sind vielversprechende Modelle, die die vorherrschenden Merkmale ihrer analogen elterlichen Tumoren beibehalten können, einschließlich histologischer Merkmale, zellulärer Vielfalt, Genexpression und Mutationsprofile. Darüber hinaus werden sie bei der Implantation in erwachsene Nagetiergehirne schnell infiltriert, was ein realistisches Modell für Drogentests und personalisierte Therapien darstellt21. Das manuelle Präparieren von Tumorgewebe zur Erzeugung von PDOs ist jedoch zeit- und kostenintensiv. Daher besteht ein dringender Bedarf an einer schnellen Methode, die eine große Anzahl von PDOs erzeugen kann und eine umfassende Bewertung verschiedener therapeutischer Ansätze ermöglicht, die für individualisierte Arzneimitteltests vielversprechend sind. Diese Studie beschreibt eine neue Methode zur Herstellung von PDOs direkt aus frisch präpariertem Tumorgewebe mit einem automatischen Gewebezerkleinerer. Darüber hinaus wurden die mit dieser Methode erzeugten PDOs mit manuell präparierten PDOs derselben Patienten in Bezug auf PDO-Anzahl, morphologische Merkmale, Apoptose und Proliferation von Tumorzellen verglichen.

Protocol

Alle Patienten wurden in der Klinik für Neurochirurgie des Universitätsklinikums Würzburg behandelt, nachdem sie eine schriftliche Einverständniserklärung gemäß der Erklärung von Helsinki und der Genehmigung durch das Institutional Review Board der Universität Würzburg (#22/20-me) abgegeben hatten. Tumorgewebematerial von vier GBM-Patienten und einem Astrozytom-, IDH-mutierten, ZNS-WHO-Grad 2-Patienten (niedriggradiges Gliom, LGG) (Tabelle 1) wurde aus der Operation gewonnen und nach dem folgenden Protokoll verarbeitet. Der automatisierte Prozess der Erzeugung von PDOs mit einem Gewebe-Chopper wird als Chopper (C) und der Prozess des manuellen Schneidens des Gewebes mit zwei Skalpellen unter mikroskopischer Kontrolle als manuell (M) bezeichnet. Sechs gleich große Schnitte (1-2 cm3) wurden aus der Tumorprobe präpariert, dann jeweils halbiert und mit den beiden Methoden homogen verarbeitet. Aufgrund der oben genannten intratumoralen Heterogenität wurde von jedem Patienten eine 6-Well-Platte für jeden Ansatz generiert, wobei jede Welle PDOs von einer anderen Stelle innerhalb des ursprünglichen Tumors repräsentiert. Beide Verfahren fanden unter einem Laminar-Airflow-Schrank statt und alle verwendeten Instrumente wurden vor der Verwendung sterilisiert. Der Überblick über den Ansatz ist in Abbildung 1 dargestellt. 1. Vorbereitung von Agaroseblöcken (nur für den C-Ansatz, optional) Füllen Sie 50 ml phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) in ein Becherglas, fügen Sie eine Tablette Agarose hinzu (siehe Materialtabelle) und mischen Sie gut, bis sie suspendiert ist. Die Mischung 30-40 s in der Mikrowelle erhitzen, dabei ein Kochen vermeiden. Anschließend die Mischung auf 47 °C abkühlen lassen. Gießen Sie die Agarosemischung in eine versiegelte zylinderförmige Gussform und vermeiden Sie Blasenbildung. Kühlen Sie den Guss sofort mit einer gefrorenen (-20 °C) Klemme ab oder legen Sie ihn 30 Minuten lang auf Trockeneis. 2. Aufbereitung des Tumormaterials Bereiten Sie eine Schachtel Eis vor, um das Tumormaterial auf dem Weg vom Operationssaal zum Labor gekühlt zu halten. Übertragen Sie das Tumorgewebe (4-5 cm³) in ein steriles 50-ml-Röhrchen mit 25 ml Hibernate A (siehe Materialtabelle), das den Tumor bedeckt, und legen Sie das Röhrchen in die Eisbox. Unter einem Laminar-Airflow-Schrank wird das Tumormaterial zusammen mit dem Hibernate A in eine sterilisierte Glas-Petrischale überführt. Entfernen Sie das nekrotische Gewebe und sezieren Sie die Blutgefäße vorsichtig mit einem Skalpell und einer Gewebezange unter mikroskopischer Kontrolle. Identifizieren Sie nekrotisches Gewebe anhand hämorrhagischer Bereiche, die einen bräunlichen Farbton infolge von Blutungen aufweisen, oder Gewebe, das im Vergleich zum angrenzenden lebensfähigen Gewebe ein blasseres oder weißeres Aussehen aufweist. Achten Sie darauf, das Gewebe nicht zu quetschen oder zu stören. Schneiden Sie das Tumormaterial in sechs Stücke mit einer ungefähren Größe von 1-2 cm3. Verteilen Sie die Stücke auf Kunststoff-Petrischalen (n = 6), die mit 3 ml H-GPSA-Medium (Tabelle 2) vorgefüllt sind, jeweils22. Die Petrischalen auf Eis legen. 3. Einrichten des Gewebezerkleinerers Positionieren Sie die Klinge wie im Herstellerhandbuch23 beschrieben. Stellen Sie die Scheibendicke auf 0,45-0,50 mm ein. Stellen Sie die Klingenkraft auf mittel ein. Bringen Sie den Tischentriegelungsknopf in den “Start”-Modus. 4. Aufbereitung der Tumorgewebestücke Aufbereitung von Tumorgewebe mit dem Chopper (C-Methode)Schneiden Sie die Agaroseblöcke in Zylinder von 2 cm Länge und kleben Sie einen dieser Zylinder mit dem Histoacrylkleber (siehe Materialtabelle) auf die runde Kunststoffschale des Zerkleinerers. Erstellen Sie mit einem Skalpell eine Vertiefung im Agarosezylinder und passen Sie dann das Tumorgewebe aus der ersten Vertiefung (Schritt 2.5) in diese Grube ein.HINWEIS: Das Tumormaterial sollte vorsichtig behandelt und nicht in den Spalt gequetscht oder gedrückt werden. Der Spalt sollte groß genug sein, um leicht in den Tumor zu passen, aber klein genug, um das Tumormaterial während des Schneidvorgangs stabil zu halten. Schritte 4.1.1. und 4.1.2. sind optional. Positionieren Sie die Kunststoffscheibe auf der Montagescheibe des Schneidetisches (siehe Materialtabelle). Schalten Sie den Chopper ein und drücken Sie die Reset-Taste . Der Häcksler beginnt nun mit dem Schneiden (erste Runde). Die Maschine stoppt automatisch, wenn der Tisch das Ende erreicht hat und sowohl Agarose- als auch Tumorgewebe in den gewünschten Durchmesser geschnitten werden. Drehen Sie die Montagescheibe um 90° und stellen Sie dann den Auslösetischknopf auf den Startmodus. Drücken Sie die Reset-Taste und lassen Sie die Maschine das Gewebe erneut schneiden, um rechteckiges Gewebe zu erzeugen (zweite Runde). Entfernen Sie die Kunststoffscheibe mit dem bearbeiteten Material und drehen Sie vorsichtig nur das Tumorgewebe mit einem Gewebespatel um 90°. Legen Sie die Kunststoffscheibe auf den Schneidetisch, stellen Sie dann den Entriegelungstischknopf auf den Startmodus und drücken Sie die Reset-Taste für eine letzte Schneidrunde (dritte Runde). Schalten Sie den Chopper aus und entfernen Sie die Kunststoffscheibe. Reinigen Sie den Zerkleinerer und die Messer. Saugen Sie das verarbeitete Material zusammen mit dem Medium mit einer 5-ml-Einkanalpipette in die Pipette an und spülen Sie die Suspension zurück in die Schale. Wiederholen Sie den vorherigen Schritt 2-3 Mal, um das Gewebe richtig zu trennen. Stellen Sie die Petrischale wieder auf Eis und wiederholen Sie die Schritte (4.1.1-4.1.12.) mit den anderen 5 Schalen jedes Tumors. Tumorgewebe manuell aufbereiten (M-Methode)Übertragen Sie das Tumorgewebe aus der ersten Kunststoff-Petrischale (Schritt 2.5) zusammen mit 3 ml H-GPSA-Medium (Tabelle 2) in eine Glas-Petrischale. Präparieren Sie das Segment manuell unter dem Mikroskop mit zwei Skalpellen in Abschnitte von 0,5 mm. Übertragen Sie das präparierte Gewebe mit einer 2-ml-Pipette zurück in die Kunststoff-Petrischale. Wiederholen Sie die Schritte (4.2.1.-4.2.3.) für die Tumorschnitte in den anderen fünf Petrischalen (Schritt 2.5). 5. Waschen des Tumorgewebes Kippen Sie jede Petrischale auf 45° nach oben und warten Sie 30 s, bis die Tumorbrocken auf den Boden der Schale sinken. Aspirieren Sie 2,5 ml des H-GPSA-Mediums (Tabelle 2) vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette und achten Sie darauf, kein Tumorgewebe aufzunehmen. Geben Sie 2 ml Erythrozyten-Lysepuffer (siehe Materialtabelle) zu jeder Probe. Die aufbereiteten Tumorstücke müssen vollständig mit Lysepuffer bedeckt sein. Stellen Sie die 6 Schalen 10 Minuten lang auf eine Labor-Orbitalschüttelmaschine bei langsamer Geschwindigkeit. Aspirieren Sie 2 ml des Lysepuffers vorsichtig, um kein Tumorgewebe aufzunehmen. Wiederholen Sie die vorherigen Waschschritte (Schritt 5.1-5.5) zweimal mit jeweils 2 ml H-GPSA-Medium (Tabelle 2) anstelle von Lysepuffer. 6. Kultivierung des Tumorgewebes Saugen Sie das H-GPSA-Medium (Tabelle 2) aus jeder Schale ab und ersetzen Sie es durch 4 ml PDO-Medium (Tabelle 2). Übertragen Sie die Gewebestücke jeder Schale in eine entsprechende Vertiefung einer 6-Well-Platte mit extrem niedrigem Anbau (siehe Materialtabelle). Die Platte wird auf einen Orbitalschüttler in einem Inkubator gestellt und 2-4 Wochen lang bei 37 °C, 5 % CO2 und 150 U/min inkubiert. Führen Sie alle zwei Tage einen halben Mediumwechsel durch, indem Sie 2 ml Medium aus jeder Vertiefung absaugen und durch 2 ml frisches PDO-Medium (Tabelle 2) ersetzen, das auf 37 °C vorgewärmt wurde. Beobachten Sie das Gewebe unter dem Mikroskop (Morphologie, Wachstum, mittlere Farbe) und schneiden Sie wachsende PDOs (>0,7 mm) oder Klebegewebe ab, um Gewebehypoxie zu vermeiden.Übertragen Sie dazu die PDOs aus der Vertiefung mit extrem niedrigem Aufsatz in eine sterilisierte Glas-Petrischale und verwenden Sie zum Schneiden ein Skalpell. Alternativ können adhäsive PDOs durch Ansaugen mit einer 1-ml-Pipette gelöst werden. Achten Sie darauf, die g.U. nicht zu quetschen und vorsichtig damit umzugehen. Bewerten Sie die PDO-Bildung, indem Sie die PDO alle zwei Tage zählen und gründlich auf die gewünschte runde Morphologie prüfen (Abbildung 2). 7. Fixierung und Einbettung der g.U. Fixieren Sie zwei PDOs aus jeder Vertiefung jedes Patienten mit 4% Formalin für 24 Stunden nach 6 Wochen Kultur. Tauchen Sie die festen g.U. bis zur Einbettung in neutral gepuffertes (Natriumphosphat) Formalin. Legen Sie jede g.U. zur weiteren Verarbeitung in eine Kassette (siehe Materialtabelle). Starten Sie einen Dehydratisierungsprozess, indem Sie die Kassette in die folgenden Lösungen tauchen, wie in der folgenden Anmerkung erwähnt:HINWEIS: 50% Ethanol für 20 min, 70% Ethanol für 20 min, 80% Ethanol für 20 min, 96% Ethanol für 20 min, 100% Ethanol für 20 min, 100% Ethanol für 30 min, 100% Ethanol + Chloroform (Verhältnis 1:1) für 30 min, 100% Ethanol + Chloroform (Verhältnis 1:1) für 30 Minuten, absolutes Chloroform für 30 min, absolutes Chloroform für 30 min, Paraffin für 30 min, Paraffin für 30 min mit dem STP 120. Betten Sie die dehydrierten g.U. bei 58-60 °C in Paraffinwachs ein. Schneiden Sie die eingebetteten PDOs auf 2,5 μm Dicke und montieren Sie sie zum Färben auf Objektträger. 8. Immunfluoreszenz-Färbung Montieren Sie die PDOs nach 6 Wochen Kultur. Anschließend führen Sie eine Doppelfärbung gegen saures Gliafibrillenprotein (GFAP, Verdünnung: 1:100) und den Proliferationsmarker Ki67 (Verdünnung: 1:1000) durch (siehe Materialtabelle), wie bereits berichtet22. Bewerten Sie in ähnlicher Weise die Apoptose durch Doppelfärbung von PDOs gegen GFAP und Anti-Caspase-3 (CC3, Verdünnung: 1:400) (siehe Materialtabelle). Nehmen Sie Bilder der PDOs mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 40-facher Vergrößerung auf. Analysieren Sie die Bilder für GFAP-, Ki67- und CC3-positive Zellen sowie doppelt positive GFAP/Ki67- und GFAP/CC3-Zellen. Nutzen Sie das Open-Source-Programm Fiji (ImageJ-win 32) für die Bildanalyse. 9. Auswertung und Datenanalyse Nehmen Sie während der ersten Woche der Kultur täglich mikroskopische Hellfeldbilder mit Standardeinstellungen und 5-facher Vergrößerung auf. Beobachten Sie die morphologischen Veränderungen und verfolgen Sie den Reifeprozess sowohl bei manuellen als auch bei automatisierten Verarbeitungsansätzen. Führen Sie morphologische Analysen mit dem Mikroskop in Standard-Hellfeldmoduseinstellungen durch. Bewerten Sie die PDO-Anzahl und -Morphologie während der ersten 4 Wochen der Kultur in PDOs von allen fünf Patienten. Erhalten Sie von jedem Patienten drei Messwerte jeder PDO-Zählung, um den Mittelwert und den Standardfehler des Mittelwerts (SEM) zu berechnen. Untersuchung der Proliferation und Apoptose bei PDOs von drei Patienten. Analysieren Sie die Daten mit einem handelsüblichen Statistik-Softwarepaket (siehe Materialtabelle). Wenden Sie Students-T- und Mann-Whitney U-Tests an, um Unterschiede zwischen der manuellen und der automatisierten PDO-Generierung in Bezug auf PDO-Anzahl, Proliferation und Apoptose zu ermitteln.

Representative Results

Vier Patienten mit GBM und einer mit LGG wurden nach pathologischer Bestätigung durch einen erfahrenen Neuropathologen (CMM) eingeschlossen. Die Mehrheit der Patienten hatte einen unmethylierten MGMT-Promotor, und alle GBM-Patienten waren IDH1- und IDH2-Wildtyp (Tabelle 1). Im Durchschnitt dauerte der Herstellungsprozess 88,8 min (+/- 6,3 min) im C-Ansatz und 322 min (+/- 17,2 min) im M-Ansatz. Die Gesamterfolgsrate betrug 87% im manuellen und 93% im Chopper-Ansatz nach 4 Wochen Kultur (n = 5). Darüber hinaus erreichten PDOs aus der C-Gruppe innerhalb von 1 Woche die gewünschte abgerundete Form und waren reif genug, um in In-vitro-Experimenten verwendet zu werden, während die PDOs der M-Gruppe meist scharfkantig und undefiniert blieben (Abbildung 2). Das mit dem C-Ansatz verarbeitete Tumorgewebe führte nach der ersten Kulturwoche zu insgesamt 281 PDOs (Mittelwert pro Patient = 56 +/- 43), während sich mit dem M-Ansatz 250 PDOs (Mittelwert pro Patient = 50 +/- 41) entwickelten. Während der zweiten Kulturwoche ergab das Gewebe aller fünf Patienten höhere PDO-Zahlen, wenn sie mit dem C-Ansatz erzeugt wurden (801; Mittelwert pro Patient = 130 +/- 38) im Vergleich zum M-Ansatz (601; Mittelwert pro Patient = 76 +/- 44; P = 0,018). Während der dritten Kulturwoche akkumulierte der C-Ansatz insgesamt 1105 PDOs von allen Patienten (Mittelwert pro Patient = 221 +/- 32) im Vergleich zu 771 PDOs (Mittelwert pro Patient = 155 +/- 34) beim M-Ansatz (P = 0,032). Darüber hinaus bildeten sich nach vierwöchiger Kultur insgesamt 1195 PDOs (Mittelwert pro Patient = 239 +/- 50), wenn sie mit dem C-Ansatz erzeugt wurden, verglichen mit 784 (Mittelwert pro Patient = 157 +/- 36) unter Verwendung des M-Ansatzes (P < 0,01). Daher zeigte die C-Methode ab der zweiten Woche eine signifikant höhere Anzahl von PDOs (Abbildung 3). Darüber hinaus wurden die relativen Schwankungen der PDO-Zahlen ausgewertet, um die dynamischen Trends zwischen aufeinanderfolgenden Wochen zu untersuchen. Die Analyse ergab einen beeindruckenden Anstieg der PDO-Zahlen während des ersten Übergangs von der ersten zur zweiten Woche des C-Ansatzes (265 %), was auf einen schnellen Fortschritt hindeutet. In der Folge gab es in der dritten Woche einen geringeren Anstieg der Zahlen (75 %), was eine vorübergehende Anpassung widerspiegelt. Im Gegensatz dazu zeigte der M-Ansatz einen konsistenten und stetigen Anstieg der PDO-Zahlen (92 % in der zweiten Woche bzw. 67 % in der dritten Woche), was zu einer bemerkenswerten Stabilität der Zählungen in der vierten Woche beitrug. Dieser stetige Aufwärtstrend bei den PDO-Zählungen unterstreicht die Zuverlässigkeit und Belastbarkeit des C-Ansatzes während des gesamten Beobachtungszeitraums. Zwei GBM-Patienten und ein LGG-Patient wurden für die Analyse der Astrozytenzahlen (GFAP) in PDOs, der PDO-Zellproliferation (Ki67) und der Apoptose (CC3) eingeschlossen. Die ermittelte Astrozytenzahl ergab keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Verarbeitungsmethoden mit durchschnittlich 43% im C-Ansatz und 45% im M-Ansatz (Abbildung 4 und Abbildung 5, Ergänzende Abbildung 1 und Ergänzende Abbildung 2). Ebenso waren die Proliferationsraten innerhalb der PDOs zwischen dem C- (3 %) und dem M-Ansatz (1 %) vergleichbar. Nur PDOs, die mit dem C-Ansatz von Patient 5 erzeugt wurden, zeigten eine Proliferationsrate von 26 % im Vergleich zu 1 % beim M-Ansatz (P = 0,001; Abbildung 4C). Insgesamt wurden niedrige Apoptoseraten in PDOs festgestellt, die mit dem C-Ansatz behandelt wurden (3 %) im Vergleich zu 2 % beim M-Ansatz für alle Patienten, die sich nicht signifikant unterschieden (Abbildung 5C). Darüber hinaus gab es keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Methoden hinsichtlich der Anzahl der Astrozyten, die Apoptose durchlaufen (Abbildung 5D). Abbildung 1: Grafischer Überblick über den Herstellungsprozess von patientenabgeleiteten Organoiden (PDO) mit einem automatisierten Zerkleinerer im Vergleich zu einem manuellen Ansatz. Die Abbildung zeigt die verschiedenen Schritte, einschließlich (A) Probenentnahme, (B) Tumormaterialdissektion, (C) Waschen und (D) Inkubation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 2: PDO-Morphologie während der ersten Kulturwoche. Vergleich der PDO-Bildung nach der Dissektion sowohl mit dem automatisierten Chopper als auch mit der manuellen Methode. Maßstabsleisten = 1000 μm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 3: PDO-Zählung während der ersten vier Wochen der Kultur. Die x-Achse zeigt die Zeit in Wochen (W) und die y-Achse die Anzahl der PDOs des C- (blau) und M-Anflugs (rot) an (n = 5). Jeder Datenpunkt stellt die mittlere Anzahl dar, wobei Fehlerbalken den Standardfehler des Mittelwerts angeben. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 4: Zellproliferationsraten innerhalb von PDOs. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder (n = 3) von GFAP-positiven Zellen (grün), Ki67-positiven Zellen (rot) und DAPI (blau) in PDOs von Patienten 3, 4 und 5 (Tabelle 1). Alle PDOs wurden mit dem Chopper (C) und dem manuellen (M) Verfahren verarbeitet. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Vergleich der beiden Methoden hinsichtlich der relativen Anzahl von GFAP-positiven Zellen, (C) Ki67-positiven Zellen und (D) Ki67/GFAP-doppelt positiven Zellen. Nicht signifikante Ergebnisse werden mit “ns” angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Apoptoseraten innerhalb von PDOs. (A) Repräsentative Immunfluoreszenzbilder (n = 3) von GFAP-positiven Zellen (grün), CC3-positiven Zellen (rot) und DAPI (blau) in PDOs von Patienten 3, 4 und 5 (Tabelle 1). Alle PDOs wurden mit dem Chopper (C) und dem manuellen (M) Verfahren verarbeitet. Maßstabsbalken = 100 μm. (B) Vergleich der beiden Methoden hinsichtlich der relativen Anzahl von GFAP-positiven Zellen, (C) CC3-positiven Zellen und (D) CC3/GFAP-doppelt positiven Zellen. Nicht signifikante Ergebnisse werden mit “ns” angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Tabelle 1: Patientenmerkmale und klinische Parameter. GBM = Glioblastom, IDH-Wildtyp, ZNS WHO Grad 4; LGG = niedriggradiges Gliom; KPS = Karnofsky-Leistungsbewertung; MGMT= O6-Methylguanin-DNA-Methyltransferase; IDH1 = Isocitrat-Dehydrogenase 1, IDH2 = Isocitrat-Dehydrogenase 2, ATRX = α-Thalassämie/geistige Behinderung, X-chromosomales Gen; M = Morphologie; CC = Zellzahl; p = Proliferation; A = Apoptose. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Tabelle 2: Mittlere Zusammensetzungen. H-GPSA = Hibernate A-Glutamax Bleistift Streptomycin Amphotericin B. PDO = Patient-derived organoids DMEM: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium. NEAA: nicht-essentielle Aminosäuren. Pen-Strepto: Penicillin/ Streptomycin Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Tabelle 3: Überblick über die verwendeten Techniken zur Generierung von Zellkulturmodellen. Bitte klicken Sie hier, um diese Tabelle herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 1: Einzelne Kanäle der Proliferationsfärbung von PDOs. (A) DAPI (blau), (B) GFAP-positive Zellen (grün), (C) Ki67-positive Zellen (rot) und (D) Overlay-Kanal in PDOs von Patienten 3, 4 und 5. Maßstabsleisten = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen. Ergänzende Abbildung 2: Einzelne Kanäle der Apoptosefärbung von PDOs. (A) DAPI (blau), (B) GFAP-positive Zellen (grün), (C) CC3-positive Zellen (rot) und (D) Overlay-Kanal in PDOs von Patienten 3, 4 und 5. Maßstabsleisten = 100 μm. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Discussion

Diese Studie stellt eine schnelle und effiziente Methode zur Generierung von PDOs vor. GBM ist nach wie vor ein schwer zu behandelnder Tumor, der häufig durch einen Rückfall und eine hohe Krankheitslast gekennzeichnet ist 3,6. Innovative Therapieansätze sind dringend erforderlich, da vielversprechende Ergebnisse, die in vitro beobachtet wurden, in Phase-I-Studien oft keine Wirksamkeit in vivo zeigen. Einer der Gründe für diese Diskrepanz könnte die begrenzte Fähigkeit von immortalisierten Zelllinien sein, die in Monolayer-Kulturen gezüchtet werden, die komplexen Zell-Zell-Interaktionen und genetischen Eigenschaften des elterlichen Tumors widerzuspiegeln. Angesichts der hohen inter- und intratumoralen Heterogenität von GBM 8,9 werden personalisierte zielgerichtete Therapien bevorzugt und können für zukünftige Anwendungen vielversprechend sein. Im Gegensatz zu 2D-adhärenten Zelllinien haben Organoide die Fähigkeit, die Eigenschaften des elterlichen Gewebeszu erhalten 21, doch komplexe Zell-Zell-Interaktionen zwischen dem Tumor und dem normalen Gehirn sind von größter Bedeutung und könnten von diesem Modell möglicherweise übersehen werden. Die manuelle Erzeugung von PDOs ist jedoch ein zeitaufwändiger Prozess, und Gewebeschäden, die durch Zusammendrücken mit Skalpellen während des Schneidens verursacht werden, können ein erfolgreiches PDO-Wachstum behindern. Daher wurde eine automatisierte Methode mit einem Gewebe-Chopper optimiert, um eine höhere Anzahl von PDOs mit reduziertem Zeit- und Arbeitsaufwand zu erzeugen. Darüber hinaus zeigten wir, dass sich die Gesamtproliferations- und Apoptoseraten zwischen den beiden Ansätzen nicht unterschieden.

Der C-Ansatz ist unkompliziert, einfach zu implementieren und ermöglicht die Generierung einer größeren Anzahl von PDOs (Abbildung 3). Die Rotation des Gewebes zwischen der zweiten und dritten Hackrunde wurde als kritischer Schritt im Protokoll identifiziert. In diesem Stadium hat das Gewebe bereits seine Integrität verloren und kann leicht auseinanderfallen, was zu größeren Stücken führt, die ein zusätzliches Schneiden oder manuelles Sezieren unter dem Mikroskop erfordern. Während der automatisierte Chopper-Ansatz eine voreingestellte Schnittgröße mit größerer Genauigkeit ermöglicht, fehlt es dem manuellen Ansatz an Präzision bei der Bestimmung der Größe von PDOs, was zu ungleichmäßig geformten und dimensionierten PDOs führt, was ein Nachteil für das vergleichende Wirkstoffscreening ist (Abbildung 2). Nichtsdestotrotz wird mit der vorgeschlagenen Methode die Standardisierung der Zellzahlen pro PDO nicht erreicht, was möglicherweise einen Nachteil für standardisierte Wirkstoff-Screening-Protokolle darstellt. Die Vor- und Nachteile verschiedener Organoid-Erzeugungstechniken 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 und ihre Anwendungen sind in Tabelle 3 zusammengefasst.

GBM-Gewebe kann in der Konsistenz variieren und von zäh (Infiltrationszone) bis weich (nekrotischer Kern) reichen, was den Ansatz des automatisierten Choppers vor Herausforderungen stellen kann. Wenn das Gewebe zu zäh ist, kann der Zerkleinerer es quetschen und beschädigen, während zu weiches Gewebe gequetscht werden kann. Das ausgewählte Gewebe wies charakteristische Eigenschaften auf, einschließlich eines mittleren Festigkeitsgrades, der sporadisch eine rosa-graue Färbung aufwies, anstatt eine braune oder gelbe Verfärbung zu zeigen. Gewebe mit einer schwammigen und leicht krümeligen Textur zeigte eine überlegene Konservierung innerhalb der Agaroseblöcke, während äußerst empfindliches und verflüssigtes Tumorgewebe aus dem Probenahmeverfahren ausgeschlossen wurde. Der Chopper-Ansatz ermöglichte jedoch eine erfolgreiche Generierung einer höheren Anzahl von PDOs im Vergleich zum manuellen Ansatz, selbst bei Gewebe mit suboptimaler Konsistenz. Die Schlüssellösung besteht darin, eine enge Interaktion mit dem Chirurgen aufrechtzuerhalten, der die Tumorresektion durchführt, um Gewebe aus verschiedenen Bereichen des Tumors zu verarbeiten. Bei suboptimaler Gewebekonsistenz war die manuelle Nachbearbeitung des Gewebes unter dem Mikroskop nach dem Zerkleinern eine hilfreiche Ergänzung. Um der Heterogenität Rechnung zu tragen, wurde das Tumorgewebe zunächst in sechs Segmente unterteilt, die anschließend entweder für den C- oder M-Zugang halbiert wurden. Innerhalb dieser sechs verschiedenen Abschnitte wird ein erhebliches Maß an Heterogenität erwartet. Darüber hinaus ist selbst innerhalb der PDOs aus demselben Abschnitt oder Bohrloch das Vorhandensein unterschiedlicher Subpopulationen plausibel.

Als Proof of Concept wurden die Proliferations- und Apoptosedaten von zwei Patienten mit GBM und einem Patienten mit LGG berichtet, die keine signifikanten Unterschiede zwischen den beiden Methoden zeigen. Die Erzeugung von PDOs ist nicht auf hochmaligne Hirntumoren beschränkt, sondern kann auch auf LGGs angewendet werden. Diese Studie hebt hervor, dass LGG selten ein Wachstum in der 2D-Kultur aufweisen, was die Entwicklung eines genauen Modells für ihre Studie sehr wertvoll macht. Dieses Protokoll zielt darauf ab, die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der schnellen und effektiven Generierung von PDOs aus GBM und LGG zu demonstrieren.

Insgesamt könnten PDOs in Zukunft für die patientenorientierte prätherapeutische Erprobung zielgerichteter Therapien bei bösartigen Hirntumoren eingesetzt werden. Die Bereitstellung einer schnellen und effizienten Methode für ein individualisiertes Wirkstoffscreening ist von entscheidender Bedeutung, da das Fortschreiten des Tumors schnell erfolgt und dringend Salvage-Behandlungsoptionen benötigt werden. In einem nächsten Schritt könnte das PDO-Modell mit verschiedenen immuntherapeutischen Ansätzen evaluiert werden, um reale Behandlungsreaktionen besser nachzuahmen. In Zukunft könnten PDOs verwendet werden, um differenzierte Schlussfolgerungen hinsichtlich der Notwendigkeit einer weiteren Erforschung und Bewertung von Therapien in einem klinischen Umfeld zu ziehen.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Forschung wurde vom Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung (IZKF, B-450) Würzburg, dem Bayerischen Zentrum für Krebsforschung (BZKF) und der Publikation durch den Open-Access-Publikationsfonds der Universität Würzburg gefördert. Wir danken Dagmar Hemmerich und Siglinde Kühnel, beide Sektion Experimentelle Neurochirurgie, Klinik für Neurochirurgie, Universitätsklinikum Würzburg, für die technische Unterstützung. Abbildung 1 wurde mit www.biorender.com erstellt.

Materials

2-mercaptoethanol (1000x) Gibco 21985023
30% formaldehyde methanol-free Carl Roth 4235.1 Used in 4% concentration
70% ethanol solution For sterilisation 
Agarose tablets 0.5 g Carl Roth HP67.7
Amphotericin B 250 µg/mL Gibco 15290018
Anatomical forceps  Hartstein  N/A
Anatomical spatula  Hartstein  N/A
B-27 Supplement without vitamin A (50x) Gibco 12587010
Biopsy cassette with cover Resolab 37001-b
Blades for McIlwain Tissue Chopper Campden instruments Model TC752-1
CC3 antibody (Asp 175) Cells signaling technology 9661
Disposable scalpel  Feather  0200130015
Distilled water Gibco 15230089 To dilute the formaldehyd
Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) Gibco 11330032 Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) Sigma Life Sciences D8537-500ML Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer Invitrogen 433357
Falcon tube 50 ml Cellstar Greiner Bio-One 227261
GFAP antibody Santa Cruz Biotechnology sc33673
Glass beaker  N/A  N/A
Glass petri dish N/A N/A
GlutaMAX (100x) Gibco 35050061
Heracell 240i CO2 Incubator Thermo scientific 51032875
Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet Thermo scientific 5016643
Hibernate-A Gibco A1247501
Histoacryl glue B. Braun surgical 1050052
Human Insulin, Solution Santa Cruz Biotechnology sc-360248
Ice box  N/A  N/A
Ki67 antibody Abcam ab16667
McIlwain Tissue Chopper Cavey Laboratory Engineering 51350V
Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B Leica DMI6000B For brightfield and immunofluorescence pictures
Microscope stereozoom S9D Leica W841832 For manual cutting and to organoids monitoring
Microwave Bosch N/A To heat the agarose solution
Mounting plastic discs Cavey Laboratory Engineering 51354
N-2 Supplement (100x) Gibco 17502048
NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) Gibco 11140050
Neurobasal (1x) Gibco 21103049
Orbital shaking machine Rotamax120 Heidolph 10304491
Penicilin Streptomycin Gibco 15140122
Plastic petri dishes Cellstar greiner bio-one 628160 n = 12
Single channel pipette 1000 µm Eppendorf 4924000010
Single channel pipette 5000 µm Eppendorf EP3123000276
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 IBM
Surgipath Paraplast Leica 39601006 Embedding medium
Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate Thermo Scientific 174932
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Alsalkini, M., Cibulková, V., Breun, M., Kessler, A. F., Schulz, T., Cattaneo, A., Wipplinger, C., Hübner, J., Ernestus, R., Nerreter, T., Monoranu, C. M., Hagemann, C., Löhr, M., Nickl, V. Cultivating Ex Vivo Patient-Derived Glioma Organoids Using a Tissue Chopper. J. Vis. Exp. (203), e65952, doi:10.3791/65952 (2024).
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