Vi har utvecklat en vävnadsbearbetningsteknik som använder en vibratom- och agarosinbäddad lungvävnad för att generera lungsnitt, vilket gör det möjligt att ta högupplösta bilder av lungarkitekturen. Vi använde immunofluorescensfärgning för att observera spatialt proteinuttryck med hjälp av specifika lungstrukturella markörer.
På grund av dess inneboende strukturella bräcklighet anses lungan vara en av de svårare vävnaderna att bearbeta för mikroskopiska avläsningar. För att lägga till strukturellt stöd för snittning bäddas bitar av lungvävnad vanligtvis in i paraffin- eller OCT-förening och skärs med en mikrotom respektive kryostat. En nyare teknik, känd som precisionsskurna lungskivor, ger strukturellt stöd till färsk lungvävnad genom agarosinfiltration och ger en plattform för att upprätthålla primär lungvävnad i odling. Men på grund av epitopmaskering och vävnadsförvrängning lämpar sig ingen av dessa tekniker tillräckligt för utveckling av reproducerbara avancerade ljusavbildningsavläsningar som skulle vara kompatibla med flera antikroppar och arter.
För detta ändamål har vi utvecklat en pipeline för vävnadsbearbetning, som använder agarosinbäddning av fixerad lungvävnad, kopplad till automatiserad vibratomsektionering. Detta underlättade genereringen av lungsektioner från 200 μm till 70 μm tjocka, i mus-, gris- och humanlungor, som inte kräver någon antigenhämtning och representerar den minst “bearbetade” versionen av den naturliga isolerade vävnaden. Med hjälp av dessa skivor avslöjar vi en multiplex avbildningsavläsning som kan generera högupplösta bilder vars rumsliga proteinuttryck kan användas för att kvantifiera och bättre förstå mekanismerna bakom lungskada och regenerering.
Ex vivo lungvävnadsskivor används i stor utsträckning i studien av lungsjukdom1. Nuvarande guldstandarder, särskilt i kliniska och translationella stordjursstudier, använder hematoxylin- och eosinfärgning i kombination med ljusfältsmikroskopi och observatörsbaserad poängsättning för att bedöma och gradera lungdysfunktion 2,3. Även om det fortfarande är en värdefull teknik, uppvisar den begränsningar när det gäller rumslig upplösning och antalet markörer som kan avbildas samtidigt. Dessutom måste lungvävnad genomgå omfattande lösningsmedelsbaserade tvättar, vilket resulterar i uttorkning, krympning och rehydrering av vävnaden innan dess slutliga avbildning4. Denna process är inte bara tidskrävande utan också miljöovänlig, maskerar proteinepitoper och kan framkalla strukturella vävnadsförändringar 5,6,7,8. För lungvävnad har dock inbäddning i paraffin före snittning varit en nödvändighet på grund av lungans strukturella bräcklighet. Däremot kan fasta organ som hjärnan skäras med hjälp av en vibrerande mikrotom (vibratom), både i fixerad och färsk vävnad 9,10,11,12.
För att möjliggöra vibratomsnitt i lungvävnad etablerades en metod som kallas precisionsskurna lungskivor (PCLS) där agaros med låg smältpunkt injiceras i färsk lungvävnad via luftvägarna eller blodkärlen och lämnas att stelna13,14. Agarosen i luftvägarna ger tillräckligt strukturellt stöd för att sedan tillåta vibratomsektion 9,14. Hos gnagare är detta enkelt att uppnå eftersom agaros kan injiceras via luftstrupen; I gris- och humanvävnad kan det dock vara svårt att hitta en lämplig luftväg/kärl inom en given biopsi15,16. Dessutom, även om en sådan luftväg/ett sådant kärl är lokaliserat, krävs vanligtvis betydande kraft för att injicera agarosen, vilket kan påverka efterföljande lungmorfologi17.
För att övervinna de utmaningar som upplevs vid paraffininbäddning/snittning/färgning och PCLS-arbetsflödet har vi etablerat en ny bearbetningspipeline för fixerad lungvävnad. Detta arbetsflöde gör det möjligt att använda en vibratom för snittning, kan producera tunnare skivor än i PCLS och ger skivor som inte kräver antigenhämtning för multiplex fluorescensavbildning. Denna metod erbjuder ett sätt att “minst bearbetning” för att generera lungsnitt som kan användas i avancerad ljusmikroskopi. Dessutom kan avbildningsavläsningar användas för att demonstrera de rumsliga förhållandena mellan celler och anatomiska strukturer i lungvävnaden genom att fånga den volymetriska arkitekturen hos vävnaden 18,19,20,21. Denna artikel beskriver protokollet för att generera dessa lungsektioner och visar multiplexfärgning applicerad på var och en av dessa vävnader och hur dessa avancerade bilddata kan användas för kvantifiering.
I detta protokoll presenterar vi en förbättrad vibratombaserad metod för att generera lungsnitt. Jämfört med paraffinbaserade bearbetningstekniker är denna metod mer kostnadseffektiv, tidseffektiv och bättre för miljön22. Dessutom hjälper denna metod till att upprätthålla den strukturella integriteten hos lungvävnadsskivor och möjliggör avancerad immunofluorescensavbildning utan behov av antigenhämtning. Men under våra experiment hittade vi också vissa begränsningar i det här arbetsflödet. Sjuka lungor kan störa skärprocessen på grund av vävnadsförstörelse orsakad av patologiska förändringar. När du använder vibratomet för snittning kan luftvägsobstruktioner och svår fibrotisk lungvävnad hindra bladet, vilket gör processen att skära dessa vävnader mer utmanande. Detta kan dock övervinnas genom att minska bladhastigheten och stödja vävnaden med en fin pensel. Liknande utmaningar uppstår på grund av förtjockning av lungsäcken, vilket är ett vanligt utfall vid lungsäcksinflammation, kronisk obstruktiv lungsjukdom (KOL) och idiopatisk lungfibros (IPF)23,24,25. Om lungsäcken inte är av intresse för ett experiment rekommenderar vi att du tar bort den före snittning eller genom isolering av en lungvolym bort från lungsäcken. Om lungsäcken är nödvändig kan den skäras med en liknande manipulation som ovan, med långsammare bladhastigheter och skivstöd från en fin borste.
Även om precisionsskurna lungskivor kan bevara den tredimensionella arkitekturen och den ursprungliga miljön i lungan26, är det viktigt att notera att generering av PCLS är en komplex och tidskrävande process. Framgången med att generera lungvävnadsskivor beror i hög grad på effektiviteten av agarosfyllning, som i sin tur påverkas av närvaron av intakt pleura och livskraftiga injektionsställen i den erhållna vävnaden. Detta är enkelt att uppnå hos gnagare eftersom agaros lätt kan föras in genom luftstrupen i intakta lungor27,28,29. Men i stordjursforskning är biopsier som tas under ett experiment vanligtvis från distala lungsegment, som saknar tillräckligt stora luftvägar för att kanylera30,31. Således, istället för att injicera agaros i bronkerna eller blodkärlen, använder vi denna metod där lungvävnad, oavsett ursprungsart eller provvolym, bäddas in i agaros med låg smältpunkt för att generera lungvävnadsskivor. Detta tillvägagångssätt är tekniskt enklare och syftar till att minimera vävnadsskador så mycket som möjligt. Baserat på vår erfarenhet har denna metod visat sig vara mer effektiv och enkel när det gäller att generera lungvävnadssnitt. Den bevarar effektivt alveolernas morfologi och är särskilt lämplig för att skära lungvävnad, vilket möjliggör generering av repeterbar högupplöst multiplex fluorescensavbildning.
I denna studie demonstrerar vi vidare två urvalsbaserade kvantifieringar för de bilddata som genereras. Den första använde bildspårning för att bedöma skillnader i alveolär storlek mellan olika arter. Föga förvånande var musalveoler de minsta, medan gris- och människoalveoler var lika stora, vilket lyfter fram grisar som en intressant translationell modell för lungforskning.
För den andra kvantifieringen jämförde vi HTII-fördelningen mellan ett lungprov från en vuxen och ett spädbarn. Typ 2-pneumocyter spelar en viktig roll i strukturen av det distala lungepitelet. Denna unika förmåga hos TII bidrar till reparation och regenerering av det alveolära epitelet32. I den friska vuxna mänskliga lungan står TII för cirka 15 % av den totala cellpopulationen, medan deras täckning av den alveolära ytan uppskattas till cirka 5 %33. HTII-280 är en allmänt erkänd lungspecifik markör för att studera utvecklingen och svaret av alveolära epitelceller på skada, och den är specifikt lokaliserad till de apikala plasmamembranen hos TII. I experimentet erhölls vuxen vävnad från en donatorpatient som avlidit på grund av intracerebral blödning och hade samtidig lungskada, medan spädbarnsprovet kom från en kvävningsrelaterad dödlighet. Våra resultat tyder på att uttrycket av HTII-280 var signifikant lägre i lungprovet hos vuxna än i spädbarnsprovet. Intressant nog, medan HTII-280 uttrycks i majoriteten av HTII, kan dess uttryck också påverkas av vävnadskvalitet, och det är signifikant reducerat i skadad mänsklig lungvävnad34. Åldrade lungvävnader uppvisar en signifikant minskning av antalet och den sekretoriska aktiviteten hos TII jämfört med unga vävnader, och äldre individer uppvisar betydligt lägre proliferation, utsöndring och anti-apoptotisk aktivitet hos TII jämfört med dessa unga vävnader35. I linje med detta kan identifiering och detektion av ett cellyteprotein som är specifikt för humana TII hjälpa till att bedöma svårighetsgraden av lungskada och utvärdera behandlingsmetoder som syftar till att förbättra lungreparationen36,37. Således, med hjälp av denna pipeline, skulle det vara av stort intresse att genomföra alveolära TII-studier i större mänskliga kohorter av hälsa och sjukdom.
Sammanfattningsvis presenterar detta protokoll ett snabbare och enklare tillvägagångssätt för att skära lungvävnad. Denna metod ger detaljerade instruktioner för beredning, skärning och färgning av lungvävnad, vilket säkerställer bevarandet av den intakta lungvävnadsstrukturen. Det optimerar modellen för att studera både friska och sjuka lungarkitekturer, vilket leder till förbättrad experimentell effektivitet. Sammantaget introducerar denna studie ett lovande tillvägagångssätt för att undersöka komplex rumslig biologi i lungvävnadens patofysiologi mellan arter, vilket kan bidra till att bättre förstå de molekylära mekanismerna som spelar in i sjukdom och reparation.
The authors have nothing to disclose.
Författarna är tacksamma för finansieringen från Stiftelsen Wallenberg Molekylär Medicin och Stamcellscentrum vid Lunds universitet samt Lund University Bioimaging Centre (LBIC) för tillgången till Nikon A1RHD.
24 well tissue culture inserts | SARSTEDT | 83.3932.300 | |
4% paraformaldehyde | SOLVECO | 6095714 | |
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher scientific | D1306 | |
50 mL Falcon tube | SARSTEDT | 2045221 | |
Cluster of differentiation 31 (CD31) | Abcam | ab28364 | |
Confocal microscope | Nikon | A1R HD25 | |
Elastin | Abcam | ab23747 | |
Epredia X1000 Coverslip | Thermo Fisher scientific | 10318963 | |
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher scientific | 10149870 | |
Forceps | AESCULAP | FB395R | |
Goat anti-mouse 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-rabbit 568 | Invitrogen | A11011 | |
Human type II cells | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | |
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher scientific | E41473 | |
Low gelling temperature Agarose | Sigma-Aldrich | 1003467046 | |
Lycopersicon Esculentum lectin | Thermo Fisher scientific | 2531965 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher scientific | 50-100-8798 | |
Plastic cup | kontorsgiganten | 885221 | |
Scissors | STILLE | 101-8380-18 | |
Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | K54329188239 | |
Super glue | LOCTITE | 2721643 | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200S |