JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Medicina

Automatisert vibratomsnitting av agarose-innebygd lungevev for multiplex fluorescensavbildning

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/65943
, ,
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine,Lund University, 2Department of Clinical Sciences,Lund University, 3Lund Stem Cell Centre,Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation,Skåne University Hospital

Summary

Vi har utviklet en vevsbehandlingsteknikk som bruker et vibratom- og agaroseinnebygd lungevev for å generere lungeseksjoner, og dermed tillate oppkjøp av høyoppløselige bilder av lungearkitektur. Vi brukte immunfluorescensfarging for å observere romlig proteinuttrykk ved hjelp av spesifikke lungestrukturelle markører.

Abstract

På grunn av sin iboende strukturelle sårbarhet regnes lungen som et av de vanskeligere vevene å behandle for mikroskopiske avlesninger. For å legge til strukturell støtte for seksjonering, er biter av lungevev vanligvis innebygd i paraffin- eller OCT-forbindelse og kuttet med henholdsvis en mikrotome eller kryostat. En nyere teknikk, kjent som presisjonskuttede lungeskiver, legger til strukturell støtte til friskt lungevev gjennom agaroseinfiltrasjon og gir en plattform for å opprettholde primær lungevev i kultur. På grunn av epitopmaskering og vevsforvrengning egner ingen av disse teknikkene seg tilstrekkelig til utvikling av reproduserbare avanserte lysavbildningsavlesninger som ville være kompatible på tvers av flere antistoffer og arter.

For dette formål har vi utviklet en vevsbehandlingsrørledning, som benytter agaroseinnebygging av fast lungevev, koblet til automatisert vibratomseksjonering. Dette muliggjorde generering av lungeseksjoner fra 200 μm til 70 μm tykke, i mus, gris og menneskelige lunger, som ikke krever antigeninnhenting, og representerer den minst “behandlede” versjonen av det opprinnelige isolerte vevet. Ved hjelp av disse skivene avslører vi en multiplex bildeavlesning som er i stand til å generere høyoppløselige bilder hvis romlige proteinuttrykk kan brukes til å kvantifisere og bedre forstå mekanismene som ligger til grunn for lungeskade og regenerering.

Introduction

Ex vivo lungevevsskiver er mye brukt i studien av lungesykdom1. Nåværende gullstandarder, spesielt i kliniske og translasjonelle store dyreforsøk, bruker hematoksylin- og eosinfarging kombinert med brightfield-mikroskopi og observatørbasert scoring for å vurdere og gradere lungedysfunksjon 2,3. Selv om det fortsatt er en verdifull teknikk, viser den begrensninger når det gjelder romlig oppløsning og antall markører som kan avbildes samtidig. Videre er lungevev nødvendig for å gjennomgå omfattende løsemiddelbaserte vasker, noe som resulterer i dehydrering, krymping og rehydrering av vevet før den endelige avbildningen4. Denne prosessen er ikke bare tidkrevende, men er også miljøvennlig, maskerer proteinepitoper, og kan påkalle strukturelle vevsendringer 5,6,7,8. For lungevev har imidlertid innebygging i parafin før snitting vært en nødvendighet på grunn av lungens strukturelle skjørhet. I motsetning til dette kan solide organer som hjernen kuttes ved hjelp av en vibrerende mikrotome (vibratom), både i fast og friskt vev 9,10,11,12.

For å muliggjøre vibratomsnitt i lungevev ble det etablert en metode som kalles presisjonskuttede lungeskiver (PCLS) der agarose med lavt smeltepunkt injiseres i friskt lungevev via luftveiene eller blodkarene og får størkne13,14. Agarose i luftveiene gir tilstrekkelig strukturell støtte til å tillate vibratomsnitt 9,14. Hos gnagere er dette enkelt å oppnå da agarose kan injiseres via luftrøret; I vev fra gris og mennesker kan det imidlertid være utfordrende å lokalisere egnede luftveier/kar innenfor en gitt biopsi15,16. Dessuten, selv om en slik luftvei/kar er lokalisert, er det vanligvis nødvendig med betydelig kraft for å injisere agarose, noe som kan påvirke senere lungemorfologi17.

For å overvinne utfordringene som oppleves innen parafininnebygging/seksjonering/farging og PCLS-arbeidsflyten, har vi etablert en ny prosesseringspipeline for fast lungevev. Denne arbeidsflyten tillater bruk av en vibratome for seksjonering, kan produsere tynnere skiver enn i PCLS, og gir skiver som ikke krever antigeninnhenting for multiplex fluorescensavbildning. Denne metoden gir et middel til “minste behandling” for å generere lungeseksjoner som kan brukes i avansert lysmikroskopi. Videre kan bildeavlesninger brukes til å demonstrere de romlige forholdene mellom celler og anatomiske strukturer i lungevevvet ved å fange den volumetriske arkitekturen til vevet 18,19,20,21. Dette papiret beskriver protokollen for å generere disse lungeseksjonene og demonstrerer multipleksflekker påført hvert av disse vevene og hvordan disse avanserte bildedataene kan brukes til kvantifisering.

Protocol

Muselungene ble donert av forskere som brukte andre organsystemer i et forsøk på å opprettholde de 3R-ene. Alle prosedyrer hos gris ble utført i henhold til EU-direktiv 2010/63/EU og ble godkjent av Malmö-Lunds etiske komité for dyreforskning (Dnr 5.8.18-05527/2019) og utført i henhold til CODEX guidelines fra Vetenskapsrådet. Godkjenning for bruk av humane prøver ble gitt av Sveriges nasjonale etiske komité (Dnr 2020-07115 og Dnr 2020-01864). Se materialfortegnelsen for detaljer knyttet til alle materialer og instrumenter som brukes i denne protokollen. 1. Forberedelse av løsninger og materialer Fest lungevevvet i 4% paraformaldehyd ved romtemperatur i 48 timer. Deretter overføres lungevevet til et 50 ml konisk rør fylt med fosfatbufret saltvann (PBS) inneholdende 0,01% natriumazid. Tilbered en 3 % (w/v) agaroseoppløsning ved å løse opp 1,5 g agarose med lavt smeltepunkt i 50 ml steril PBS. Klar en plastkopp, fin tang og steril saks. Varm agarosen i mikrobølgeovnen til den koker, avkjøl den deretter ned til 42 °C i vannbad. Hold agarose i flytende form ved å lagre den i vannbadet til den er klar til bruk.MERK: Mens du oppvarmer agarose, se mikrobølgeovnen til den begynner å koke slik at den ikke renner over. Dette tar vanligvis rundt 1,5 min. 2. Lungevev innebygd i agarose Løft lungebiopsien fra PBS-azidet og dissekere lungelappene forsiktig med fin tang og steril saks. Klipp lungelappen i mindre blokker.MERK: Selv om snitting med pleura er mulig, kan de tykke elastinbuntene hindre skjæring med vibratombladet. Derfor anbefaler vi at den fjernes hvis det ikke er nødvendig. Klipp en plastkopp gjennom midten og tilsett en liten mengde agarose til bunnen. Plasser lokket fra en 50 ml konisk tube (kant fjernet) på overflaten av agarose, og oppbevar koppen ved 4 °C i 5 minutter slik at agarose kan stivne for senere bruk. Hent plastkoppen fra kjøleskapet på 4 °C, tilsett ca. 1 ml flytende agarose på lokket, og plasser deretter lungevevsblokken forsiktig på lokket. La agarose stå i 2-3 min for å halvstørkne ved romtemperatur. Hell deretter væsken agarose sakte på lungevevvet til den er helt nedsenket. Sett i kjøleskap ved 4 °C i ca. 15 minutter til agarosen stivner. Bruk deretter et skarpt blad forsiktig for å fjerne ekstra agarose som omgir lungevevet, og etterlater et jevnt lag på ca. 5 mm tykkelse rundt vevet (figur 1). 3. Kutting av lungevevsseksjoner For å forberede lungevevet for seksjonering, fest hver vevsblokk på prøveskiven til vibratomet ved hjelp av superlim. Deretter fyller du vibratombufferbrettet med PBS og legger is i det omkringliggende isbadet. Til slutt installerer du prøvedisken forsiktig i bufferbrettet. Skjær lungevevet med vibratomet med følgende innstillinger: tykkelse: 200 μm, frekvens: 100 Hz, bladets amplitude: 1,3 mm og bladets hastighet fremover på 0,02-0,03 mm/s, som avhenger av vevsstivhet.MERK: Skjæring er mulig ned til en tykkelse på 70 μm hvis bladhastigheten reduseres til 0,01 mm / s. Enkelte vibratomer (f.eks. Leica V1200) tillater automatisering av seksjonering ved å sette inn et skjærevindu. For å samle seksjoner, overfør forsiktig vevskiven ved å øse den med en børste fra vibratombrettet til en 24-brønnsplate fylt med 0,01% azid i PBS. Til slutt bevares lungeskivene ved 4 °C. 4. Immunfarging av elastin, CD31, HTII-280 og SMA Permeabiliser og blokker (1% bovint serumalbumin + 0,5% Triton + 5% normalt geiteserum) vevet ved 4 °C under forsiktig risting i 45 minutter. Fortynn de primære antistoffene (SMA 1:500; elastin 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) i PBS, tilsett 300 μL i per brønn, og inkuber over natten ved 4 °C under lett risting. Uten å berøre skiven og fjerne primærantistoffene med en pipettespiss, vask 3 x 20 min (400 μL) med PBS. Fortynn de sekundære antistoffene (1:1000) i PBS, tilsett 300 μL i per brønn, og inkuber ved 4 °C under lett risting i 90 minutter. Fjern de sekundære antistoffene med en pipettespiss, tilsett 4′,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) (1:1000) og tomatlektin-488 (1:500) i en 30 minutters inkubasjon, og vask i 3 x 10 minutter med PBS. Plasser tre dråper monteringsmedium på lysbildet, monter et deksel og fortsett til avbildning.

Representative Results

Prosessen med å generere lungevevsskiver innebærer flere viktige trinn, inkludert forberedelse, innebygging og seksjonering. Agaroseoppløsningen (3 % (w/v) fremstilles ved å oppløse 1,5 g agarose med lavt smeltepunkt i 50 ml steril PBS. Forbruksvarer som trengs inkluderer en plastkopp, lokk fra et 50 ml konisk rør (kant fjernet), tang og saks. Lungevevet resekteres forsiktig i mindre blokker med fin tang og steril saks (figur 1A,B). Deretter, for å legge inn lungevevsblokkene, fylles bunnen av koppen med en liten mengde agarose, et lokk legges på overflaten av agarose, og koppen lagres ved 4 ° C i 5 minutter (figur 1C). Omtrent 1 ml flytende agarose tilsettes til lokket, og lungevevsblokken plasseres på lokket. Agarosen får stå i 2-3 minutter for å halvstørkne ved romtemperatur (figur 1D). Når en lungeblokk holdes på plass av den halvstørknede agarose, helles flytende agarose i koppen til lungevevsblokken er helt nedsenket. Dette oppbevares ved 4 °C i 15 minutter (figur 1E,F). Lavsmeltepunkt-agarose-embedding gir den nødvendige støtten og stivheten til lungevevvet, noe som bidrar til å opprettholde sin opprinnelige arkitektur under kutteprosessen. Et skarpt blad brukes til å fjerne overflødig agarose som omgir lungevevvet. Et jevnt lag på ca. 5 mm tykkelse er igjen rundt vevet (figur 1G). Den utskårne lungevevsblokken limes deretter forsiktig på vevsholderen (figur 1H). Vibratombufferbrettet er fylt med PBS, is er plassert i det omkringliggende isbadet, og prøveskiven er installert i bufferbrettet (figur 1I). Vibratomskjæreparametrene som ble satt på panelet var: skivetykkelse: 200 μm; frekvens: 100 Hz; amplitude på bladet: 1,3 mm; Bladets hastighet fremover: 0,02–0,03 mm/s, som avhenger av vevsstivhet (figur 1J). Til slutt utføres farging på frittflytende skiver (figur 1K-M). Immunfluorescensfarging ble utført i 200 μm seksjoner fra hver art for glatt muskelaktin (SMA, glatt muskelcelle og myofibroblastmarkør), elastin (ekstracellulært matriksprotein) og Lycopersicon Esculentum lektin (LEA), som binder seg til bronkoalveolære epitelceller. Lungen er et strukturelt heterogent vev, og som sådan observeres differensiell SMA- og elastinfordeling på tvers av strukturer, inkludert alveolære kanaler, blodkar, intrapulmonale bronkioler og alveoler fra mus, griser og mennesker (figur 2A-L). En høyoppløselig gjengivelse av et 20 μm volum av en bronkiol viser hvordan fine strukturer i lungen kan undersøkes på et semi-tredimensjonalt nivå (Supplemental Video S1). Som et kvantitativt eksempel, ved hjelp av bildesporing, viser vi hvordan størrelsen på alveolene varierer mellom prøvene (n = 20 alveoler) (figur 2L,M). For å vise hvordan det er mulig å kvantitativt utnytte disse avanserte bildedataene, sammenlignet vi type 2 pneumocytt (TII) cellefordelinger i humant lungevev fra en voksen og et spedbarn. Det humanspesifikke type 2 alveolære celleantistoffet, HTII-280, har en sterk affinitet til overflaten av humane type 2-celler (figur 3A-F). Disse cellene kan videre ses i det tredimensjonale rommet til en enkelt alveolus ved hjelp av volumetrisk avbildning (Supplemental Video S2). For å kvantifisere TII-tallet mellom voksen- og spedbarnsprøvene behandlet vi HTII-280-tellingen over 10 tilfeldige synsfelt (fov). Mellom disse prøvene ga spedbarnsprøven signifikant høyere TII-celletall (figur 3G). Spedbarnsprøven hadde imidlertid også signifikant høyere stillasdekning enn den voksne, noe som kunne forklare det høyere celletallet (figur 3H). For å ta hensyn til dette vurderte vi deretter antall TIIer basert på stillasdekning, som celler per mm2 vev, som fortsatt opprettholdt et signifikant høyere antall TIIer i spedbarnsprøven (figur 3I). Det høyere TII-tallet i spedbarnsprøven skyldes altså ikke økt stillasdekning og understreker viktigheten av å vurdere cellefordelingen i lungen basert på stillasets areal, ikke den totale FOV. Figur 1: Protokoll for skjæring av lungevevsskiver. (A) Løsningene og materialene: en 3% (w / v) agaroseoppløsning oppnådd ved oppløsning av 1,5 g agarose med lavt smeltepunkt i 50 ml sterilt fosfatbufret saltvann; en plastkopp; et lokk fra 50 ml konisk rør; tang og saks. (B) Lungevevet ble dissekert ved hjelp av tynn tang og steril saks. (C) Fyll bunnen av koppen med en liten mengde agarose og legg lokket på overflaten av agarose; Deretter oppbevares den ved 4 °C i 5 minutter. (D) Tilsett 1-2 ml flytende agarose til lokket sakte, legg lungevevsbiten forsiktig på lokket og oppbevar den ved 4 °C i 2 minutter. (E,F) Hell væsken agarose i koppen til lungevevsbiten er helt nedsenket, oppbevar den ved 4 °C i 15 minutter, Og bryt deretter plastkoppen forsiktig. (G) Bruk et skarpt blad for å fjerne overflødig agarose som omgir lungevevet, og etterlater et jevnt lag på ca. 5 mm tykkelse rundt vevet. (H) Den utskårne lungevevsblokken limes deretter forsiktig på vevsholderen. (I) Fyll vibratombufferbrettet med PBS, legg is i det omkringliggende isbadet og installer prøveskiven i bufferbrettet. (J) Sett skjæreparametere på vibratompanelet; skivetykkelse: 200 μm, frekvens: 100 Hz, knivens amplitude: 1,3 mm, og bladets hastighet fremover på 0,02-0,04 mm/s. (KM) Representative bilder av en frittflytende skive som fortsatt er innebygd i agarose og klar for immunfluorescensfarging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: Immunfluorescensbilder av lungestruktur hos mennesker, gris og mus. (A-L) Representative bilder av en alveolær kanal, blodkar, bronkiol og alveoler i lungevevsskiver fra henholdsvis mus, gris og menneske. SMA (vist i grønt) er en markør for glatte muskelceller og observeres i vaskulære og bronkiale vegger i lungevev. Elastin (vist i rødt) er en del av den ekstracellulære matrisen i lungene. (M) Kvantifisering av alveolær størrelse ved å velge 20 tilfeldige posisjoner på hver lungevevsskive for både menneske-, gris- og museprøver. Histogrammer ble brukt for å illustrere fordelingen av alveolær størrelse i hver gruppe. Skalastenger = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). Kruskall-Wallis test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lektin; SMA = glatt muskel aktin; ms = mus; hmn = menneske. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3. Distribusjon av pneumoocytter type 2 i prøver fra voksne og spedbarn. (A,B) Representative bilder av humant lungevev fra voksne og spedbarn farget for HTII-280 (vist i rødt), CD31 (vist i grønt) og LEA (vist i grått). (C,D) Representative bilder av voksne og spedbarn viser pneumocyttfordeling type 2 alene. (E,F) Enkeltcelleoppløsning representative bilder av en individuell type 2 pneumocytt fra voksne og spedbarn humane lungeprøver. G) Kvantifisering av antall pneumocytter av type 2 mellom prøver fra voksne og spedbarn. (H) Kvantifisering av lungevevets stillasområdedekning (% vs luft) i prøver fra voksne og spedbarn. (I) Kvantifisering av type 2 pneumocytt per mm2 vev i voksen- og spedbarnsprøver. Skalastenger = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 fov per prøve. Uparet t-test eller Mann-Whitney-test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: DAPI = 4', 6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lektin; HTII = humane type II-celler; CD31 = Blodplateendotelcelleadhesjonsmolekyl-1/klynge av differensiering 31; FOV = synsfelt. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Tilleggsvideo S1: Video av 20 μm avbildningsvolum av en enkelt svineluftvei farget med DAPI, LEA, SMA og elastin som viser en høyoppløselig visning av strukturen til luftveisveggelementer. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lektin; SMA = glatt muskelaktin. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsvideo S2: Video av 30 μm avbildningsvolum av en enkelt alveolus farget med DAPI, LEA og HTII-280 som viser type 2 pneumocyttfordeling over hele strukturen. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lektin; SMA = glatt muskelaktin. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I denne protokollen presenterer vi en forbedret vibratombasert metode for generering av lungeseksjoner. Sammenlignet med parafinbaserte prosesseringsteknikker er denne metoden mer kostnadseffektiv, tidseffektiv og bedre for miljøet22. Videre bidrar denne metoden til å opprettholde den strukturelle integriteten til lungevevsskiver og muliggjør avansert immunfluorescensavbildning uten behov for antigeninnhenting. Men under eksperimentene våre fant vi også visse begrensninger for denne arbeidsflyten. Syke lunger kan forstyrre skjæreprosessen på grunn av ødeleggelse av vev forårsaket av patologiske forandringer. Mens du bruker vibratomet til seksjonering, kan luftveishindringer og alvorlig fibrotisk lungevev hindre bladet, noe som gjør prosessen med å kutte disse vevene mer utfordrende. Dette kan imidlertid overvinnes ved å redusere bladhastigheten og støtte vevet med en fin pensel. Lignende utfordringer oppstår ved fortykkelse av pleura, som er et vanlig utfall ved pleuritt, kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) og idiopatisk lungefibrose (IPF)23,24,25. Hvis pleura ikke er av interesse for et forsøk, anbefaler vi å fjerne den før snitt eller isolere lungevolum vekk fra pleura. Hvis pleura er nødvendig, kan den skives ved hjelp av en lignende manipulasjon som ovenfor, med langsommere bladhastigheter og skivestøtte fra en fin børste.

Mens presisjonskuttede lungeskiver kan bevare den tredimensjonale arkitekturen og det opprinnelige miljøet i lungen26, er det viktig å merke seg at generering av PCLS er en kompleks og tidkrevende prosess. Suksessen med å generere lungevevskiver avhenger i stor grad av effektiviteten av agarosefylling, som igjen påvirkes av tilstedeværelsen av intakt pleura og levedyktige injeksjonssteder i det oppnådde vevet. Dette er enkelt å oppnå hos gnagere, da agarose lett kan føres gjennom luftrøret inn i intakte lunger27,28,29. Men i store dyreforsøk er biopsier tatt over et eksperiment vanligvis fra distale lungesegmenter, som mangler en stor nok luftvei til å kanylere30,31. Således, i stedet for å injisere agarose i bronkus eller blodkar, vedtar vi denne metoden der lungevev, uavhengig av opprinnelsesart eller prøvevolum, er innebygd i agarose med lavt smeltepunkt for å generere lungevevskiver. Denne tilnærmingen er teknisk enklere og tar sikte på å minimere vevskader så mye som mulig. Basert på vår erfaring har denne metoden vist høyere effektivitet og letthet i å generere lungevevseksjoner. Det bevarer effektivt morfologien til alveolene og er spesielt egnet for kutting av lungevev, noe som muliggjør generering av repeterbar høyoppløselig multiplex fluorescensavbildning.

I denne studien demonstrerer vi videre to utvalgsbaserte kvantifiseringer for bildedataene som genereres. Den første benyttet bildesporing for å vurdere forskjeller i alveolær størrelse på tvers av artsprøver. Ikke overraskende var musealveolene de minste, mens gris og menneskelige alveoler var like i størrelse, og fremhevet griser som en interessant translasjonsmodell for lungeforskning.

For den andre kvantifiseringen sammenlignet vi HTII-fordelingen mellom en voksen og spedbarns lungeprøve. Type 2 pneumocytter spiller en viktig rolle i strukturen til det distale lungeepitelet. Denne unike evnen til TIIs bidrar til reparasjon og regenerering av det alveolære epitelet32. I den friske voksne humane lungen utgjør TII ca. 15 % av den totale cellepopulasjonen, mens deres dekning av alveolaroverflaten er estimert til å være rundt 5 %33. HTII-280 er en anerkjent lungespesifikk markør for å studere utvikling og respons av alveolære epitelceller til skade, og den er spesifikt lokalisert til de apikale plasmamembranene til TII. I forsøket ble voksenvev hentet fra en donorpasient som døde på grunn av intracerebral blødning og hadde samtidig lungeskade, mens spedbarnsprøven kom fra en kvelningsrelatert dødelighet. Våre funn tyder på at uttrykket av HTII-280 var signifikant lavere i voksen lungeprøve enn i spedbarnsprøven. Interessant, mens HTII-280 uttrykkes i de fleste HTII, kan uttrykket også påvirkes av vevskvalitet, og det er betydelig redusert i skadet humant lungevev34. Alderen lungevev viser en signifikant reduksjon i antall og sekretorisk aktivitet av TIIs sammenlignet med unge vev, og eldre individer viser betydelig lavere spredning, sekresjon og anti-apoptotisk aktivitet av TIIs i forhold til de unge vev35. I tråd med dette kan identifisering og påvisning av et celleoverflateprotein spesifikt for humane TIIer hjelpe til med å vurdere alvorlighetsgraden av lungeskade og evaluere behandlingsmetoder for å forbedre lungereparasjon36,37. Ved hjelp av denne rørledningen ville det derfor være av stor interesse å gjennomføre alveolære TII-studier i større menneskelige kohorter av helse og sykdom.

Avslutningsvis presenterer denne protokollen en raskere og enklere tilnærming for å kutte lungevev. Denne metoden gir detaljerte instruksjoner for forberedelse av lungevev, skjæring og farging, og sikrer bevaring av den intakte lungevevstrukturen. Det optimaliserer modellen for å studere både sunn og syk lungearkitektur, noe som fører til forbedret eksperimentell effektivitet. Samlet sett introduserer denne studien en lovende tilnærming til å undersøke kompleks romlig biologi i lungevevpatofysiologi på tvers av arter, noe som kan bidra til å bedre forstå molekylære mekanismer som spiller i sykdom og reparasjon.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkjenner takknemlig finansiering mottatt fra Wallenberg Molecular Medicine Foundation og Stem Cell Center ved Lunds universitet og anerkjenner Lunds universitet Bioimaging Centre (LBIC) for tilgang til Nikon A1RHD.

Materials

24 well tissue culture inserts SARSTEDT 83.3932.300
4% paraformaldehyde SOLVECO 6095714
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher scientific D1306
50 mL Falcon tube  SARSTEDT 2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31) Abcam ab28364
Confocal microscope  Nikon A1R HD25
Elastin Abcam ab23747
Epredia X1000 Coverslip Thermo Fisher scientific 10318963
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher scientific 10149870
Forceps AESCULAP FB395R
Goat anti-mouse 647  Invitrogen  A21235
Goat anti-rabbit 568 Invitrogen  A11011
Human type II cells Terrace Biotech TB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher scientific E41473
Low gelling temperature Agarose Sigma-Aldrich 1003467046
Lycopersicon Esculentum lectin Thermo Fisher scientific 2531965
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher scientific 50-100-8798
Plastic cup kontorsgiganten 885221
Scissors STILLE 101-8380-18
Smooth muscle actin Abcam ab5694
Sodium azide Sigma-Aldrich K54329188239
Super glue LOCTITE 2721643
Vibrating microtome Leica VT1200S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Biología del desarrollo. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -. H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -. X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

Tags

Vibratome SectioningAgarose EmbeddingMultiplex Fluorescence ImagingLarge Animal ModelsSpatial BiologyImmunofluorescenceLight Sheet Fluorescence MicroscopyLung Transplant RejectionSpatial Protein Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Wang, Q., Bechet, N. B., Lindstedt, S. Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (200), e65943, doi:10.3791/65943 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image