हमने फेफड़ों के वर्गों को उत्पन्न करने के लिए एक वाइब्रेटोम और एगरोज-एम्बेडेड फेफड़े के ऊतकों का उपयोग करके एक ऊतक-प्रसंस्करण तकनीक विकसित की है, जिससे फेफड़ों की वास्तुकला की उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों के अधिग्रहण की अनुमति मिलती है। हमने विशिष्ट फेफड़े के संरचनात्मक मार्करों का उपयोग करके स्थानिक प्रोटीन अभिव्यक्ति का निरीक्षण करने के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला कर दिया।
इसकी अंतर्निहित संरचनात्मक नाजुकता के कारण, फेफड़े को सूक्ष्म रीडआउट के लिए संसाधित करने के लिए अधिक कठिन ऊतकों में से एक माना जाता है। सेक्शनिंग के लिए संरचनात्मक समर्थन जोड़ने के लिए, फेफड़े के ऊतकों के टुकड़े आमतौर पर पैराफिन या ओसीटी यौगिक में एम्बेडेड होते हैं और क्रमशः माइक्रोटोम या क्रायोस्टेट के साथ काटे जाते हैं। एक और हालिया तकनीक, जिसे सटीक-कट फेफड़े के स्लाइस के रूप में जाना जाता है, अगारोज घुसपैठ के माध्यम से ताजा फेफड़े के ऊतकों को संरचनात्मक समर्थन जोड़ता है और संस्कृति में प्राथमिक फेफड़े के ऊतकों को बनाए रखने के लिए एक मंच प्रदान करता है। हालांकि, एपिटोप मास्किंग और ऊतक विरूपण के कारण, इनमें से कोई भी तकनीक पर्याप्त रूप से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उन्नत प्रकाश इमेजिंग रीडआउट के विकास के लिए खुद को उधार नहीं देती है जो कई एंटीबॉडी और प्रजातियों में संगत होगी।
यह अंत करने के लिए, हमने एक ऊतक-प्रसंस्करण पाइपलाइन विकसित की है, जो निश्चित फेफड़ों के ऊतकों के एगरोज एम्बेडिंग का उपयोग करती है, जो स्वचालित वाइब्रेटोम सेक्शनिंग के साथ मिलकर होती है। इसने माउस, सुअर और मानव फेफड़ों में 200 माइक्रोन से 70 माइक्रोन मोटी फेफड़ों के फेफड़ों की पीढ़ी की सुविधा प्रदान की, जिसके लिए कोई एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं होती है, और देशी पृथक ऊतक के कम से कम “संसाधित” संस्करण का प्रतिनिधित्व करते हैं। इन स्लाइस का उपयोग करते हुए, हम एक मल्टीप्लेक्स इमेजिंग रीडआउट प्रकट करते हैं जो उच्च-रिज़ॉल्यूशन छवियों को उत्पन्न करने में सक्षम है जिनकी स्थानिक प्रोटीन अभिव्यक्ति का उपयोग फेफड़ों की चोट और उत्थान के अंतर्निहित तंत्र को मापने और बेहतर ढंग से समझने के लिए किया जा सकता है।
पूर्व विवो फेफड़े के ऊतक स्लाइस बड़े पैमाने पर फेफड़ों की बीमारी1 के अध्ययन में उपयोग किया जाता है। वर्तमान सोने के मानकों, विशेष रूप से नैदानिक और अनुवाद बड़े पशु अध्ययन में, hematoxylin और eosin धुंधला रोजगार brightfield माइक्रोस्कोपी और पर्यवेक्षक आधारित स्कोरिंग के साथ मिलकर आकलन और ग्रेड फेफड़ों की शिथिलता 2,3. जबकि अभी भी एक मूल्यवान तकनीक है, यह स्थानिक संकल्प और मार्करों की संख्या के संदर्भ में सीमाओं को प्रदर्शित करता है जिन्हें एक साथ चित्रित किया जा सकता है। इसके अलावा, फेफड़े के ऊतकों को व्यापक विलायक-आधारित washes से गुजरना पड़ता है, जिसके परिणामस्वरूप निर्जलीकरण, संकोचन और इसकी अंतिम इमेजिंग4 से पहले ऊतक का पुनर्जलीकरण होता है। यह प्रक्रिया न केवल समय लेने वाली है, बल्कि पर्यावरण के अनुकूल भी है, प्रोटीन एपिटोप्स को मास्क करती है, और संरचनात्मक ऊतक परिवर्तन 5,6,7,8 का आह्वान कर सकती है। हालांकि, फेफड़ों के ऊतकों के लिए, सेक्शनिंग से पहले पैराफिन में एम्बेड करना फेफड़े की संरचनात्मक नाजुकता के कारण एक आवश्यकता रही है। इसके विपरीत, मस्तिष्क जैसे ठोस अंगों को एक कंपन माइक्रोटोम (वाइब्रेटोम) का उपयोग करके काटा जा सकता है, दोनों निश्चित और ताजा ऊतक 9,10,11,12 में।
फेफड़े के ऊतकों में vibratome सेक्शनिंग सक्षम करने के लिए, एक विधि परिशुद्धता कट फेफड़े स्लाइस (पीसीएलएस) कहा जाता है जहां कम पिघलने बिंदु agarose वायुमार्ग या रक्त वाहिकाओं के माध्यम से ताजा फेफड़ों के ऊतकों में इंजेक्ट किया जाता है और13,14 जमने के लिए छोड़ दिया गया था. वायुमार्ग में agarose तो vibratome अनुभाग 9,14 की अनुमति देने के लिए पर्याप्त संरचनात्मक समर्थन प्रदान करता है. कृन्तकों में, यह प्राप्त करना आसान है क्योंकि श्वासनली के माध्यम से अगारोज़ को इंजेक्ट किया जा सकता है; हालांकि, सुअर और मानव ऊतक में, यह एक दिया बायोप्सी15,16 के भीतर एक उपयुक्त वायुमार्ग/पोत का पता लगाने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है. पोत स्थित है, तो भी अगर इस तरह के एक वायुमार्ग/पोत स्थित है, पर्याप्त बल आमतौर पर बाद फेफड़ों की आकृति विज्ञान17 को प्रभावित कर सकते हैं जो agarose, इंजेक्ट करने के लिए आवश्यक है.
पैराफिन एम्बेडिंग/सेक्शनिंग/धुंधला और पीसीएलएस वर्कफ़्लो में अनुभव की गई चुनौतियों को दूर करने के लिए, हमने निश्चित फेफड़ों के ऊतकों के लिए एक नई प्रसंस्करण पाइपलाइन स्थापित की है। यह वर्कफ़्लो सेक्शनिंग के लिए वाइब्रेटोम के उपयोग की अनुमति देता है, पीसीएलएस की तुलना में पतले स्लाइस का उत्पादन कर सकता है, और मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इमेजिंग के लिए एंटीजन पुनर्प्राप्ति की आवश्यकता नहीं है कि स्लाइस पैदा करता है। यह विधि फेफड़ों के वर्गों को उत्पन्न करने के लिए “कम से कम प्रसंस्करण” का एक साधन प्रदान करती है जिसका उपयोग उन्नत प्रकाश माइक्रोस्कोपी में किया जा सकता है। इसके अलावा, इमेजिंग रीडआउट का उपयोग ऊतक 18,19,20,21के वॉल्यूमेट्रिक आर्किटेक्चर को कैप्चर करके फेफड़ों के ऊतकों के भीतर कोशिकाओं और शारीरिक संरचनाओं के स्थानिक संबंधों को प्रदर्शित करने के लिए किया जा सकता है। यह पत्र इन फेफड़ों के वर्गों को उत्पन्न करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और इन ऊतकों में से प्रत्येक पर लागू मल्टीप्लेक्स दाग को प्रदर्शित करता है और इन उन्नत इमेजिंग डेटा का उपयोग परिमाणीकरण के लिए कैसे किया जा सकता है।
इस प्रोटोकॉल में, हम फेफड़े वर्गों को उत्पन्न करने के लिए एक बेहतर vibratome आधारित विधि प्रस्तुत करते हैं. पैराफिन आधारित प्रसंस्करण तकनीकों की तुलना में, इस विधि अधिक लागत प्रभावी, समय कुशल, और पर्यावरण22 के लिए बेहतर है. इसके अलावा, इस विधि फुफ्फुसीय ऊतक स्लाइस की संरचनात्मक अखंडता को बनाए रखने में मदद करता है और प्रतिजन पुनर्प्राप्ति के लिए की आवश्यकता के बिना उन्नत immunofluorescence इमेजिंग के लिए अनुमति देता है. हालाँकि, हमारे प्रयोगों के दौरान, हमें इस वर्कफ़्लो की कुछ सीमाएँ भी मिलीं। रोगग्रस्त फेफड़े रोग परिवर्तनों के कारण ऊतक विनाश के कारण काटने की प्रक्रिया में हस्तक्षेप कर सकते हैं। सेक्शनिंग के लिए वाइब्रेटोम का उपयोग करते समय, वायुमार्ग की रुकावटें और गंभीर फाइब्रोटिक फेफड़े के ऊतक ब्लेड को बाधित कर सकते हैं, जिससे इन ऊतकों को काटने की प्रक्रिया अधिक चुनौतीपूर्ण हो जाती है। हालांकि, ब्लेड की गति को कम करके और एक ठीक तूलिका के साथ ऊतक का समर्थन करके इसे दूर किया जा सकता है। इसी तरह की चुनौतियां फुफ्फुस के मोटा होने से उत्पन्न होती हैं, जो फुफ्फुसशोथ में एक सामान्य परिणाम है, पुरानी प्रतिरोधी फुफ्फुसीय रोग (सीओपीडी), और इडियोपैथिक फुफ्फुसीय फाइब्रोसिस (आईपीएफ)23,24,25। फुफ्फुस एक प्रयोग के लिए ब्याज की नहीं है, तो, हम यह सेक्शनिंग से पहले या अलगाव से दूर एक फेफड़ों की मात्रा से दूर हटाने की सलाह देते हैं. यदि फुफ्फुस का आवरण आवश्यक है, तो इसे ऊपर के समान हेरफेर का उपयोग करके काटा जा सकता है, जिसमें धीमी ब्लेड गति और एक ठीक ब्रश से टुकड़ा समर्थन शामिल है।
जबकि सटीक-कट फेफड़े के स्लाइस फेफड़ों के त्रि-आयामी वास्तुकला और देशी वातावरण को संरक्षित कर सकते हैं26, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि पीसीएलएस उत्पन्न करना एक जटिल और समय लेने वाली प्रक्रिया है। फेफड़े के ऊतक स्लाइस पैदा करने की सफलता बहुत हद तक agarose भरने की दक्षता पर निर्भर करती है, जो बदले में, प्राप्त ऊतक में बरकरार फुफ्फुस का आवरण और व्यवहार्य इंजेक्शन साइटों की उपस्थिति से प्रभावित होती है। कृन्तकों में प्राप्त करना आसान है क्योंकि अगारोज को श्वासनली के माध्यम से बरकरार फेफड़ों में आसानी से पेश किया जा सकता है27,28,29. हालांकि, बड़े पशु अनुसंधान में, एक प्रयोग भर में लिया बायोप्सी आम तौर पर बाहर का फेफड़े खंडों, जोcannulate करने के लिए एक बड़ा पर्याप्त वायुमार्ग की कमी से कर रहे हैं 30,31. इस प्रकार, ब्रोन्कस या रक्त वाहिकाओं में एगरोज को इंजेक्ट करने के बजाय, हम इस पद्धति को अपनाते हैं जहां फेफड़े के ऊतक, मूल या नमूना मात्रा की प्रजातियों की परवाह किए बिना, फेफड़े के ऊतक स्लाइस उत्पन्न करने के लिए कम-पिघलने-बिंदु एगरोज में एम्बेडेड होते हैं। यह दृष्टिकोण तकनीकी रूप से आसान है और इसका उद्देश्य जितना संभव हो ऊतक क्षति को कम करना है। हमारे अनुभव के आधार पर, इस विधि ने फेफड़ों के ऊतक वर्गों को उत्पन्न करने में उच्च दक्षता और आसानी का प्रदर्शन किया है। यह प्रभावी रूप से एल्वियोली की आकृति विज्ञान को संरक्षित करता है और फेफड़ों के ऊतकों को काटने के लिए विशेष रूप से उपयुक्त है, जिससे दोहराए जाने योग्य उच्च-रिज़ॉल्यूशन मल्टीप्लेक्स प्रतिदीप्ति इमेजिंग की पीढ़ी को सक्षम किया जा सकता है।
इस अध्ययन में, हम आगे उत्पन्न इमेजिंग डेटा के लिए दो नमूना आधारित मात्रा का प्रदर्शन करते हैं। प्रजातियों के नमूनों में वायुकोशीय आकार में अंतर का आकलन करने के लिए पहली बार उपयोग की गई छवि अनुरेखण। अप्रत्याशित रूप से, माउस एल्वियोली सबसे छोटे थे, जबकि सुअर और मानव एल्वियोली आकार में समान थे, सूअरों को फेफड़ों के अनुसंधान के लिए एक दिलचस्प अनुवाद मॉडल के रूप में उजागर करते थे।
दूसरी मात्रा के लिए, हमने एक वयस्क और शिशु फेफड़ों के नमूने के बीच एचटीआईआई वितरण की तुलना की। टाइप 2 न्यूमोसाइट्स डिस्टल फेफड़े के उपकला की संरचना में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। टीआईआई की यह अनूठी क्षमता वायुकोशीय उपकला32 की मरम्मत और पुनर्जनन में योगदान देती है। स्वस्थ वयस्क मानव फेफड़े में, टीआईआई कुल कोशिका आबादी का लगभग 15% हिस्सा है, जबकि वायुकोशीय सतह क्षेत्र का उनका कवरेज लगभग 5%33 होने का अनुमान है। HTII-280 चोट के लिए वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं के विकास और प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक व्यापक रूप से मान्यता प्राप्त फेफड़े-विशिष्ट मार्कर है, और यह विशेष रूप से TIIs के एपिकल प्लाज्मा झिल्ली के लिए स्थानीयकृत है। प्रयोग में, वयस्क ऊतक एक दाता रोगी से प्राप्त किया गया था जो इंट्रासेरेब्रल रक्तस्राव के कारण मर गया था और समवर्ती फेफड़ों की चोट थी, जबकि शिशु का नमूना श्वासावरोध से संबंधित मृत्यु दर से आया था। हमारे निष्कर्षों से संकेत मिलता है कि शिशु के नमूने की तुलना में वयस्क फेफड़ों के नमूने में एचटीआईआई -280 की अभिव्यक्ति काफी कम थी। दिलचस्प है, जबकि HTII-280 HTIIs के बहुमत में व्यक्त किया जाता है, इसकी अभिव्यक्ति भी ऊतक की गुणवत्ता से प्रभावित किया जा सकता है, और यह काफी घायल मानव फेफड़ों के ऊतकों34 में कम हो गया है. वृद्ध फेफड़े के ऊतकों युवा ऊतकों की तुलना में टीआईआई की संख्या और स्रावी गतिविधि में उल्लेखनीय कमी का प्रदर्शन, और बुजुर्ग व्यक्तियों उन युवा ऊतकों35 की तुलना में काफी कम प्रसार, स्राव और टीआईआई के विरोधी एपोप्टोटिक गतिविधि का प्रदर्शन करते हैं। इस के साथ ध्यान में रखते हुए, पहचान और मानव TIIs के लिए विशिष्ट एक सेल सतह प्रोटीन की पहचान और पता लगाने फेफड़ों की चोट की गंभीरता का आकलन करने और फेफड़ों की मरम्मत36,37 को बढ़ाने के उद्देश्य से उपचार दृष्टिकोण का मूल्यांकन करने में सहायता कर सकता है. इस प्रकार, इस पाइपलाइन का उपयोग करते हुए, स्वास्थ्य और बीमारी के बड़े मानव समूहों में वायुकोशीय टीआईआई अध्ययन करना बहुत रुचि होगी।
अंत में, इस प्रोटोकॉल फेफड़ों के ऊतकों को काटने के लिए एक तेजी से और आसान दृष्टिकोण प्रस्तुत करता है. यह विधि फेफड़ों के ऊतकों की तैयारी, काटने और धुंधला होने के लिए विस्तृत निर्देश प्रदान करती है, जिससे बरकरार फेफड़े के ऊतकों की संरचना का संरक्षण सुनिश्चित होता है। यह स्वस्थ और रोगग्रस्त फेफड़ों की वास्तुकला दोनों का अध्ययन करने के लिए मॉडल का अनुकूलन करता है, जिससे प्रयोगात्मक दक्षता में सुधार होता है। कुल मिलाकर, यह अध्ययन प्रजातियों में फेफड़े के ऊतकों के पैथोफिज़ियोलॉजी में जटिल स्थानिक जीव विज्ञान की जांच करने के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण का परिचय देता है, जो रोग और मरम्मत में खेलने वाले आणविक तंत्र को बेहतर ढंग से समझने में मदद कर सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक कृतज्ञतापूर्वक लुंड विश्वविद्यालय के वॉलनबर्ग मॉलिक्यूलर मेडिसिन फाउंडेशन और स्टेम सेल सेंटर से प्राप्त धन को स्वीकार करते हैं और निकॉन ए 1 आरएचडी तक पहुंच के लिए लुंड यूनिवर्सिटी बायोइमेजिंग सेंटर (एलबीआईसी) को स्वीकार करते हैं।
24 well tissue culture inserts | SARSTEDT | 83.3932.300 | |
4% paraformaldehyde | SOLVECO | 6095714 | |
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher scientific | D1306 | |
50 mL Falcon tube | SARSTEDT | 2045221 | |
Cluster of differentiation 31 (CD31) | Abcam | ab28364 | |
Confocal microscope | Nikon | A1R HD25 | |
Elastin | Abcam | ab23747 | |
Epredia X1000 Coverslip | Thermo Fisher scientific | 10318963 | |
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher scientific | 10149870 | |
Forceps | AESCULAP | FB395R | |
Goat anti-mouse 647 | Invitrogen | A21235 | |
Goat anti-rabbit 568 | Invitrogen | A11011 | |
Human type II cells | Terrace Biotech | TB-27AHT2-280 | |
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium | Thermo Fisher scientific | E41473 | |
Low gelling temperature Agarose | Sigma-Aldrich | 1003467046 | |
Lycopersicon Esculentum lectin | Thermo Fisher scientific | 2531965 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher scientific | 50-100-8798 | |
Plastic cup | kontorsgiganten | 885221 | |
Scissors | STILLE | 101-8380-18 | |
Smooth muscle actin | Abcam | ab5694 | |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | K54329188239 | |
Super glue | LOCTITE | 2721643 | |
Vibrating microtome | Leica | VT1200S |