JoVE Journal > Medicine
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Divulgaciones
Acknowledgements
Materials
Referencias
Medicina

Automatiseret vibratomsektionering af agaroseindlejret lungevæv til multiplexfluorescensbilleddannelse

Published: October 06, 2023
doi:
10.3791/65943
, ,
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine,Lund University, 2Department of Clinical Sciences,Lund University, 3Lund Stem Cell Centre,Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation,Skåne University Hospital

Summary

Vi har udviklet en vævsbehandlingsteknik, der bruger et vibratom- og agaroseindlejret lungevæv til at generere lungesektioner, hvilket muliggør erhvervelse af billeder i høj opløsning af lungearkitektur. Vi anvendte immunfluorescensfarvning til at observere rumlig proteinekspression ved hjælp af specifikke lungestrukturelle markører.

Abstract

På grund af sin iboende strukturelle skrøbelighed betragtes lungen som et af de vanskeligere væv at behandle til mikroskopiske aflæsninger. For at tilføje strukturel støtte til sektionering er stykker lungevæv almindeligvis indlejret i paraffin- eller OCT-forbindelse og skåret med henholdsvis et mikrotomt eller kryostat. En nyere teknik, kendt som præcisionskårne lungeskiver, tilføjer strukturel støtte til frisk lungevæv gennem agaroseinfiltration og giver en platform til at opretholde primært lungevæv i kultur. På grund af epitopmaskering og vævsforvrængning egner ingen af disse teknikker sig imidlertid tilstrækkeligt til udvikling af reproducerbare avancerede lysbilleddannelsesaflæsninger, der ville være kompatible på tværs af flere antistoffer og arter.

Til dette formål har vi udviklet en vævsbehandlingspipeline, der udnytter agaroseindlejring af fast lungevæv, koblet til automatiseret vibratomsektionering. Dette lettede dannelsen af lungesektioner fra 200 μm til 70 μm tykke i mus, svin og menneskelige lunger, som ikke kræver antigenudtagning og repræsenterer den mindst “behandlede” version af det indfødte isolerede væv. Ved hjælp af disse skiver afslører vi en multiplexbilleddannelsesudlæsning, der er i stand til at generere billeder i høj opløsning, hvis rumlige proteinekspression kan bruges til at kvantificere og bedre forstå mekanismerne bag lungeskade og regenerering.

Introduction

Ex vivo lungevævsskiver anvendes i vid udstrækning i undersøgelsen af lungesygdom1. Nuværende guldstandarder, især i kliniske og translationelle store dyreforsøg, anvender hæmatoxylin og eosinfarvning kombineret med brightfieldmikroskopi og observatørbaseret scoring til at vurdere og klassificere lungedysfunktion 2,3. Selvom det stadig er en værdifuld teknik, udviser den begrænsninger med hensyn til rumlig opløsning og antallet af markører, der kan afbildes samtidigt. Desuden kræves lungevæv at gennemgå omfattende opløsningsmiddelbaserede vasker, hvilket resulterer i dehydrering, krympning og rehydrering af vævet inden dets endelige billeddannelse4. Denne proces er ikke kun tidskrævende, men er også miljømæssigt uvenlig, maskerer proteinepitoper og kan påberåbe sig strukturelle vævsændringer 5,6,7,8. For lungevæv har indlejring i paraffin før sektionering imidlertid været en nødvendighed på grund af lungens strukturelle skrøbelighed. I modsætning hertil kan faste organer som hjernen skæres ved hjælp af et vibrerende mikrotomt (vibratom), både i fast og frisk væv 9,10,11,12.

For at muliggøre vibratomsektionering i lungevæv blev der etableret en metode kaldet præcisionsskårne lungeskiver (PCLS), hvor agarose med lavt smeltepunkt injiceres i frisk lungevæv via luftvejene eller blodkarrene og efterlades til at størkne13,14. Agarosen i luftvejene giver tilstrækkelig strukturel støtte til derefter at tillade vibratomsektionering 9,14. Hos gnavere er dette nemt at opnå, da agarose kan injiceres via luftrøret; I svine- og humanvæv kan det imidlertid være en udfordring at lokalisere en egnet luftvej/beholder inden for en given biopsi15,16. Selv om en sådan luftvej/beholder er lokaliseret, kræves der normalt betydelig kraft for at injicere agarose, hvilket kan påvirke den efterfølgende lungemorfologi17.

For at overvinde udfordringerne inden for paraffinindlejring/sektionering/farvning og PCLS-arbejdsgangen har vi etableret en ny behandlingspipeline til fast lungevæv. Denne arbejdsgang tillader brug af et vibratomt til sektionering, kan producere tyndere skiver end i PCLS og giver skiver, der ikke kræver antigenhentning til multiplexfluorescensbilleddannelse. Denne metode tilbyder et middel til “mindst behandling” til at generere lungesektioner, der kan bruges i avanceret lysmikroskopi. Desuden kan billeddannelsesaflæsninger bruges til at demonstrere de rumlige forhold mellem celler og anatomiske strukturer i lungevævet ved at fange vævets volumetriske arkitektur 18,19,20,21. Dette papir beskriver protokollen til generering af disse lungesektioner og demonstrerer multiplexpletter påført hvert af disse væv, og hvordan disse avancerede billeddannelsesdata kan bruges til kvantificering.

Protocol

Muslunger blev doneret af forskere ved hjælp af andre organsystemer i et forsøg på at opretholde 3R’erne. Alle forsøg på svin blev udført i overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63/EU og blev godkendt af Malmö-Lunds etiske komité for dyreforskning (Dnr 5.8.18-05527/2019) og udført i henhold til CODEX-retningslinjerne fra det svenske forskningsråd. Godkendelse til anvendelse af humane prøver blev givet af den svenske nationale etiske komité (Dnr 2020-07115 og Dnr 2020-01864). Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer og instrumenter, der anvendes i denne protokol. 1. Fremstilling af opløsninger og materialer Fastgør lungevævet i 4% paraformaldehyd ved stuetemperatur i 48 timer. Derefter overføres lungevævet til et 50 ml konisk rør fyldt med fosfatbufret saltvand (PBS) indeholdende 0,01% natriumazid. Der fremstilles en 3% (w/v) agaroseopløsning ved at opløse 1,5 g agarose med lavt smeltepunkt i 50 ml steril PBS. Klar en plastikkop, fine tang og steril saks. Agaroseen opvarmes i mikrobølgeovn, indtil den koger, og afkøles derefter til 42 °C i vandbad. Opbevar agarosen i flydende form ved at opbevare den i vandbadet, indtil den er klar til brug.BEMÆRK: Mens du opvarmer agarose, skal du se mikrobølgeovnen, indtil den begynder at koge, så den ikke løber over. Dette tager normalt omkring 1,5 min. 2. Lungevæv indlejret i agarose Løft lungebiopsien fra PBS-azidet og disseker forsigtigt lungelapperne med fine pincet og sterile saks. Skær lungelapen i mindre blokke.BEMÆRK: Mens sektionering med pleura er mulig, kan dens tykke elastinbundter forhindre skæring med vibratombladet. Derfor anbefaler vi, at det fjernes, hvis det ikke er nødvendigt. Skær en plastikkop gennem midten og tilsæt en lille mængde agarose til bunden. Anbring låget fra et 50 ml konisk rør (kant fjernet) på agaroseens overflade, og opbevar koppen ved 4 °C i 5 minutter, så agarosen kan størkne til senere brug. Tag plastikkoppen ud af 4 °C køleskabet, tilsæt ca. 1 ml flydende agarose på låget, og anbring derefter forsigtigt lungevævsblokken på låget. Lad agaroseen stå i 2-3 minutter for at størkne ved stuetemperatur. Hæld derefter langsomt den flydende agarose på lungevævet, indtil det er helt nedsænket. Opbevares i køleskab ved 4 °C i ca. 15 minutter, indtil agarosen størkner. Brug derefter forsigtigt et skarpt blad til at fjerne ekstra agarose omkring lungevævet, hvilket efterlader et ensartet lag på ca. 5 mm tykkelse omkring vævet (figur 1). 3. Skæring af lungevævssektioner For at forberede lungevævet til sektionering skal du fastgøre hver vævsblok på vibratomens prøveskive ved hjælp af superlim. Fyld derefter vibratombufferbakken med PBS og læg is i det omgivende isbad. Til sidst skal du forsigtigt installere prøvedisken i bufferbakken. Skær lungevævet i skiver med vibratomet med følgende indstillinger: tykkelse: 200 μm, frekvens: 100 Hz, bladets amplitude: 1,3 mm og bladets fremadgående hastighed på 0,02-0,03 mm/s, hvilket afhænger af vævsstivhed.BEMÆRK: Skæring er mulig ned til en tykkelse på 70 μm, hvis klingehastigheden reduceres til 0,01 mm/s. Visse vibraatomer (f.eks. Leica V1200) muliggør automatisering af sektionering ved at indstille et skærevindue. For at samle sektioner overføres forsigtigt vævsskiven ved at øse den med en børste fra vibratombakken til en plade med 24 brønde fyldt med 0,01% azid i PBS. Endelig opbevares lungeskiverne ved 4 °C. 4. Immunfarvning af elastin, CD31, HTII-280 og SMA Permeabilisere og blokere (1% bovin serumalbumin + 0,5% Triton + 5% normalt gedeserum) vævet ved 4 °C under forsigtig omrystning i 45 min. Fortynd de primære antistoffer (SMA 1:500; elastin 1:250; CD31 1:250; HTII-280 1:250) i PBS, tilsættes 300 μL pr. hul og inkuberes natten over ved 4 °C under forsigtig omrystning. Uden at røre skiven og fjerne de primære antistoffer med en pipettespids, vaskes 3 x 20 min (400 μL) med PBS. De sekundære antistoffer (1:1000) fortyndes i PBS, der tilsættes 300 μl pr. hul, og der inkuberes ved 4 °C under forsigtig omrystning i 90 minutter. De sekundære antistoffer fjernes med en pipettespids, tilsættes 4′,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) (1:1000) og tomatlectin-488 (1:500) i 30 minutters inkubation, og vask i 3 x 10 minutter med PBS. Placer tre dråber monteringsmedium på diaset, monter en dæksel, og fortsæt til billeddannelse.

Representative Results

Processen med at generere lungevævsskiver involverer flere vigtige trin, herunder forberedelse, indlejring og sektionering. Agaroseopløsningen (3% (w/v) fremstilles ved at opløse 1,5 g agarose med lavt smeltepunkt i 50 ml steril PBS. Forbrugsvarer, der er nødvendige, inkluderer en plastikkop, låg fra et 50 ml konisk rør (kant fjernet), tang og saks. Lungevævet resekteres omhyggeligt i mindre blokke med fin pincet og steril saks (figur 1A, B). For at indlejre lungevævsblokkene fyldes bunden af koppen med en lille mængde agarose, et låg placeres på agaroseens overflade, og koppen opbevares ved 4 ° C i 5 minutter (figur 1C). Ca. 1 ml flydende agarose tilsættes til låget, og lungevævsblokken placeres på låget. Agarosen efterlades i 2-3 minutter for at størkne ved stuetemperatur (figur 1D). Når en lungeblok holdes på plads af den halvstørknede agarose, hældes flydende agarose derefter i koppen, indtil lungevævsblokken er helt nedsænket. Dette opbevares ved 4 °C i 15 minutter (figur 1E,F). Agaroseindlejringen med lavt smeltepunkt giver den nødvendige støtte og stivhed til lungevævet, hvilket hjælper med at bevare sin oprindelige arkitektur under udskæringsprocessen. Et skarpt blad bruges til at fjerne overskydende agarose, der omgiver lungevævet. Der efterlades et ensartet lag på ca. 5 mm tykkelse omkring vævet (figur 1G). Den udskårne lungevævsblok limes derefter forsigtigt på vævsholderen (figur 1H). Vibratombufferbakken fyldes med PBS, is placeres i det omgivende isbad, og prøveskiven installeres i bufferbakken (figur 1I). Vibratomskæringsparametrene indstillet på panelet var: skivetykkelse: 200 μm; frekvens: 100 Hz; bladets amplitude: 1,3 mm; Bladets hastighed fremad: 0,02-0,03 mm/s, hvilket afhænger af vævets stivhed (figur 1J). Endelig udføres farvning på fritflydende skiver (figur 1K-M). Immunofluorescensfarvning blev udført i 200 μm sektioner fra hver art for glat muskelaktin (SMA, en glat muskelcelle og myofibroblastmarkør), elastin (ekstracellulært matrixprotein) og Lycopersicon Esculentum lectin (LEA), som binder til bronchoalveolære epitelceller. Lungen er et strukturelt heterogent væv, og som sådan observeres differentiel SMA- og elastinfordeling på tværs af strukturer, herunder alveolære kanaler, blodkar, intrapulmonale bronchioler og alveoler fra mus, svin og mennesker (figur 2A-L). En højopløsningsgengivelse af et 20 μm volumen af en bronchiole viser, hvordan fine strukturer i lungen kan undersøges på et semi-tredimensionelt niveau (Supplemental Video S1). Som et kvantitativt eksempel viser vi ved hjælp af billedsporing, hvordan alveolernes størrelse adskiller sig mellem prøver (n = 20 alveoler) (figur 2L, M). For at vise, hvordan det er muligt kvantitativt at udnytte disse avancerede billeddannelsesdata, sammenlignede vi type 2 pneumocyt (TII) cellefordelinger i humant lungevæv fra en voksen og et spædbarn. Det humanspecifikke type 2 alveolære celleantistof, HTII-280, har en stærk affinitet til overfladen af humane type 2-celler (figur 3A-F). Disse celler kan yderligere ses i det tredimensionelle rum af en enkelt alveolus ved hjælp af volumetrisk billeddannelse (supplerende video S2). For at kvantificere TII-tallet mellem voksen- og spædbarnsprøverne behandlede vi HTII-280-tællingen på tværs af 10 tilfældige synsfelter (fov). Mellem disse prøver gav spædbarnsprøven et signifikant højere TII-celletal (figur 3G). Spædbarnsprøven udviste imidlertid også en signifikant højere stilladsdækning end den voksne, hvilket kunne forklare det højere celletal (figur 3H). For at tage højde for dette vurderede vi derefter antallet af TII’er baseret på stilladsdækning som celler pr. mm2 væv, som stadig opretholdt et signifikant højere antal TII’er i spædbarnsprøven (figur 3I). Det højere TII-tal i spædbarnsprøven skyldes således ikke øget stilladsdækning og fremhæver vigtigheden af at vurdere cellefordelinger i lungen baseret på stilladsets areal, ikke den samlede fov. Figur 1: Protokol til skæring af lungevævsskiver. A) Opløsninger og materialer: en 3 vægtprocent agaroseopløsning opnået ved opløsning af 1,5 g agarose med lavt smeltepunkt i 50 ml sterilt fosfatbufret saltvand en plastik kop; et låg fra 50 ml konisk rør; tang og saks. (B) Lungevævet blev dissekeret ved hjælp af fine pincet og sterile saks. (C) Fyld bunden af bægeret med en lille mængde agarose og læg låget på agaroseens overflade; opbevar den derefter ved 4 °C i 5 min. (D) Tilsæt langsomt 1-2 ml flydende agarose til låget, læg forsigtigt lungevævsstykket på låget, og opbevar det ved 4 °C i 2 min. (E,F) Hæld den flydende agarose i koppen, indtil lungevævsstykket er helt nedsænket, opbevar det ved 4 °C i 15 minutter, Og bryd derefter plastikkoppen forsigtigt. (G) Brug et skarpt blad til at fjerne overskydende agarose omkring lungevævet, så der efterlades et ensartet lag på ca. 5 mm tykkelse omkring vævet. (H) Den udskårne lungevævsblok limes derefter forsigtigt på vævsholderen. (I) Fyld vibratombufferbakken med PBS, læg is i det omgivende isbad, og installer prøvedisken i bufferbakken. (J) Indstil skæreparametre på vibratumets panel; skivetykkelse: 200 μm, frekvens: 100 Hz, knivens amplitude: 1,3 mm og bladets fremadgående hastighed på 0,02-0,04 mm/s. (K-M) Repræsentative billeder af en fritflydende skive, der stadig er indlejret i agarose og klar til immunofluorescensfarvning. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 2: Immunofluorescensbilleder af lungestruktur hos mennesker, svin og mus. (A-L) Repræsentative billeder af en alveolær kanal, blodkar, bronchiol og alveoler i lungevævsskiver fra henholdsvis mus, gris og menneske. SMA (vist i grønt) er en markør for glatte muskelceller og observeres i lungevævets vaskulære og bronchiale vægge. Elastin (vist med rødt) udgør en del af lungernes ekstracellulære matrix. (M) Kvantificering af alveolær størrelse ved at vælge 20 tilfældige positioner på hver lungevævsskive til både humane prøver, svin og mus. Histogrammer blev brugt til at illustrere fordelingen af alveolær størrelse inden for hver gruppe. Skalastænger = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). Kruskall-Wallis Test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = glat muskelaktin; ms = mus; hmn = menneske. Klik her for at se en større version af denne figur. Figur 3. Type 2 pneumocytfordeling i humane voksen- og spædbørnsprøver. (A,B) Repræsentative billeder af humant lungevæv fra voksne og spædbørn plettet for HTII-280 (vist med rødt), CD31 (vist med grønt) og LEA (vist med gråt). (C,D) Repræsentative billeder af voksne og spædbørn, der viser type 2 pneumocytfordeling alene. (E,F) Enkeltcelleopløsning, repræsentative billeder af en individuel type 2-pneumocyt fra humane lungeprøver fra voksne og spædbørn. G) Kvantificering af antallet af type 2-pneumocytter mellem prøver fra voksne og spædbørn. (H) Kvantificering af lungevævsstilladsets arealdækning (% vs luft) i prøver fra voksne og spædbørn. I) Kvantificering af type 2-pneumocyt pr.mm2 væv i prøver fra voksne og spædbørn. Skalastænger = 5 μm (E, F), 100 μm (A-D). n = 10 fov pr. prøve. Uparret t-test eller Mann-Whitney Test. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Forkortelser: DAPI = 4', 6-diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; HTII = humane type II-celler CD31 = Trombocytendotelcelleadhæsionsmolekyle-1/klynge af differentiering 31; FOV = synsfelt. Klik her for at se en større version af denne figur. Supplerende Video S1: Video af 20 μm billedvolumen af en enkelt svineluftvejs farvet ved hjælp af DAPI, LEA, SMA og elastin, der viser en højopløsningsvisning af strukturen af luftvejsvægelementer. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = glat muskelaktin. Klik her for at downloade denne fil. Supplerende Video S2: Video af 30 μm billedvolumen af en enkelt alveolus farvet ved hjælp af DAPI, LEA, og HTII-280, der viser type 2 pneumocytfordeling over strukturen. Forkortelser: DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindol; LEA = Lycopersicon Esculentum lectin; SMA = glat muskelaktin. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne protokol præsenterer vi en forbedret vibratombaseret metode til generering af lungesektioner. Sammenlignet med paraffinbaserede forarbejdningsteknikker er denne metode mere omkostningseffektiv, tidseffektiv og bedre for miljøet22. Desuden hjælper denne metode med at opretholde den strukturelle integritet af lungevævsskiver og muliggør avanceret immunfluorescensbilleddannelse uden behov for antigenhentning. Under vores eksperimenter fandt vi dog også visse begrænsninger for denne arbejdsgang. Syge lunger kan forstyrre skæreprocessen på grund af vævsødelæggelse forårsaget af patologiske ændringer. Mens du bruger vibratomet til sektionering, kan luftvejsobstruktioner og alvorligt fibrotisk lungevæv hæmme bladet, hvilket gør processen med at skære disse væv mere udfordrende. Dette kan dog overvindes ved at reducere bladhastigheden og støtte vævet med en fin pensel. Lignende udfordringer stammer fra fortykkelsen af lungehinden, som er et almindeligt resultat ved lungehindebetændelse, kronisk obstruktiv lungesygdom (KOL) og idiopatisk lungefibrose (IPF)23,24,25. Hvis lungehinden ikke er af interesse for et eksperiment, anbefaler vi at fjerne den før sektionering eller ved isolering af et lungevolumen væk fra lungehinden. Hvis lungehinden er nødvendig, kan den skæres i skiver ved hjælp af en lignende manipulation som ovenfor, hvilket involverer langsommere bladhastigheder og skivestøtte fra en fin børste.

Mens præcisionsskårne lungeskiver kan bevare lungens tredimensionelle arkitektur og oprindelige miljø26, er det vigtigt at bemærke, at generering af PCLS er en kompleks og tidskrævende proces. Succesen med at generere lungevævsskiver afhænger i høj grad af effektiviteten af agarosefyldning, som igen påvirkes af tilstedeværelsen af intakt pleura og levedygtige injektionssteder i det opnåede væv. Dette er nemt at opnå hos gnavere, da agarose let kan indføres gennem luftrøret i intakte lunger27,28,29. I store dyreforsøg er biopsier taget på tværs af et eksperiment typisk fra distale lungesegmenter, som mangler en stor nok luftvej til at kannulere30,31. I stedet for at injicere agarose i bronchus eller blodkar anvender vi således denne metode, hvor lungevæv, uanset oprindelsesart eller prøvevolumen, er indlejret i agarose med lavt smeltepunkt for at generere lungevævsskiver. Denne tilgang er teknisk lettere og sigter mod at minimere vævsskader så meget som muligt. Baseret på vores erfaring har denne metode vist højere effektivitet og lethed ved generering af lungevævssektioner. Det bevarer effektivt alveolernes morfologi og er særligt velegnet til skæring af lungevæv, hvilket muliggør generering af gentagelig multiplexfluorescensbilleddannelse med høj opløsning.

I denne undersøgelse demonstrerer vi yderligere to prøvebaserede kvantificeringer for de genererede billeddata. Den første brugte billedsporing til at vurdere forskelle i alveolær størrelse på tværs af artsprøver. Ikke overraskende var musalveoler de mindste, mens svin og humane alveoler var ens i størrelse, hvilket fremhævede grise som en interessant translationel model for lungeforskning.

Til den anden kvantificering sammenlignede vi HTII-fordelingen mellem en voksen og spædbarnslungeprøve. Type 2 pneumocytter spiller en afgørende rolle i strukturen af det distale lungeepitel. Denne unikke evne af TII’er bidrager til reparation og regenerering af det alveolære epitel32. I den raske voksne menneskelige lunge tegner TII’er sig for ca. 15% af den samlede cellepopulation, mens deres dækning af det alveolære overfladeareal anslås at være omkring 5%33. HTII-280 er en bredt anerkendt lungespecifik markør til undersøgelse af udviklingen og responsen af alveolære epitelceller til skade, og den er specifikt lokaliseret til de apikale plasmamembraner af TII’er. I forsøget blev voksent væv opnået fra en donorpatient, der døde på grund af intracerebral blødning og havde samtidig lungeskade, mens spædbarnsprøven kom fra en kvælningsrelateret dødelighed. Vores resultater indikerer, at ekspressionen af HTII-280 var signifikant lavere i den voksne lungeprøve end i spædbarnsprøven. Interessant nok, mens HTII-280 udtrykkes i de fleste HTII’er, kan dets udtryk også påvirkes af vævskvalitet, og det reduceres signifikant i skadet humant lungevæv34. Ældre lungevæv udviser et signifikant fald i antallet og sekretorisk aktivitet af TII’er sammenlignet med unge væv, og ældre individer viser betydeligt lavere proliferation, sekretion og anti-apoptotisk aktivitet af TII’er sammenlignet med de unge væv35. I overensstemmelse hermed kan identifikation og påvisning af et celleoverfladeprotein, der er specifikt for humane TII’er, hjælpe med at vurdere sværhedsgraden af lungeskade og evaluere behandlingsmetoder, der sigter mod at forbedre lungereparation36,37. Ved at udnytte denne pipeline ville det således være af stor interesse at gennemføre alveolære TII-undersøgelser i større humane kohorter af sundhed og sygdom.

Afslutningsvis præsenterer denne protokol en hurtigere og lettere tilgang til skæring af lungevæv. Denne metode giver detaljerede instruktioner til lungevævsforberedelse, skæring og farvning, hvilket sikrer bevarelsen af den intakte lungevævsstruktur. Det optimerer modellen til at studere både sund og syg lungearkitektur, hvilket fører til forbedret eksperimentel effektivitet. Samlet set introducerer denne undersøgelse en lovende tilgang til at undersøge kompleks rumlig biologi i lungevævspatofysiologi på tværs af arter, hvilket kan bidrage til bedre at forstå de molekylære mekanismer, der er på spil i sygdom og reparation.

Divulgaciones

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkender taknemmeligt finansiering modtaget fra Wallenberg Molecular Medicine Foundation og Stem Cell Center ved Lunds Universitet og anerkender Lund University Bioimaging Centre (LBIC) for adgang til Nikon A1RHD.

Materials

24 well tissue culture inserts SARSTEDT 83.3932.300
4% paraformaldehyde SOLVECO 6095714
4’, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher scientific D1306
50 mL Falcon tube  SARSTEDT 2045221
Cluster of differentiation 31 (CD31) Abcam ab28364
Confocal microscope  Nikon A1R HD25
Elastin Abcam ab23747
Epredia X1000 Coverslip Thermo Fisher scientific 10318963
Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides Thermo Fisher scientific 10149870
Forceps AESCULAP FB395R
Goat anti-mouse 647  Invitrogen  A21235
Goat anti-rabbit 568 Invitrogen  A11011
Human type II cells Terrace Biotech TB-27AHT2-280 
Invitrogen Fluoromount-G Mounting Medium Thermo Fisher scientific E41473
Low gelling temperature Agarose Sigma-Aldrich 1003467046
Lycopersicon Esculentum lectin Thermo Fisher scientific 2531965
Phosphate-buffered saline (PBS) Thermo Fisher scientific 50-100-8798
Plastic cup kontorsgiganten 885221
Scissors STILLE 101-8380-18
Smooth muscle actin Abcam ab5694
Sodium azide Sigma-Aldrich K54329188239
Super glue LOCTITE 2721643
Vibrating microtome Leica VT1200S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referencias

  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493 (2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815 (2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376 (2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2 (2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36 (2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889 (2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162 (2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348 (2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Biología del desarrollo. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016 (2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970 (2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465 (2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392 (2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985 (1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566 (2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -. H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -. X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

Tags

Vibratome SectioningAgarose EmbeddingMultiplex Fluorescence ImagingLarge Animal ModelsSpatial BiologyImmunofluorescenceLight Sheet Fluorescence MicroscopyLung Transplant RejectionSpatial Protein Expression

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artículo
Wang, Q., Bechet, N. B., Lindstedt, S. Automated Vibratome Sectioning of Agarose-Embedded Lung Tissue for Multiplex Fluorescence Imaging. J. Vis. Exp. (200), e65943, doi:10.3791/65943 (2023).
Descargar cita
Reimpresiones y permisos

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image