طريقة سلوكية متعددة الاستخدامات للتحقيق في تأثيرات هرمون الغدة الدرقية على وظيفة المخيخ
Summary
نقدم هنا بروتوكولا لاختبار سلوك متعدد الاستخدامات تم تطويره مؤخرا ، وهو اختبار شعاع السلم. يتميز هذا الاختبار باكتشاف الرنح المخيخي الخفي الناجم عن خلل في عمل هرمون الغدة الدرقية في الجهاز العصبي المركزي مقارنة باختبارات السلوك التقليدية التي تقيم الأداء الحركي.
Abstract
عمل هرمون الغدة الدرقية (TH) ضروري أثناء تطور الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك المخيخ. في حالة نقص TH في الحياة المبكرة مثل قصور الغدة الدرقية الخلقي ، يظهر المرضى اضطرابات عصبية مثل التخلف المعرفي والعجز الحركي. هناك العديد من الدراسات التي تستخدم نماذج الفئران مع نقص TH الخاص بالأنسجة أو الخلايا للتحقيق في دور TH في المخيخ. بالمقارنة مع الفئران الخلقية المعممة قصور الغدة الدرقية ، تظهر الفئران التي تعاني من نقص TH في الخلايا المخيخية ميزات رنح أكثر اعتدالا ودقة ، مما يجعل تقييم الوظيفة الحركية صعبا عند استخدام الاختبارات التقليدية مثل اختبار الروتارد.
نظرا للحاجة إلى أداة بديلة لتقييم الوظيفة الحركية في النماذج الحيوانية ذات الصلة ب TH ، قمنا بتطوير طريقة سلوكية متعددة الاستخدامات تسمى “اختبار شعاع السلم” ، حيث يمكننا تصميم اختبارات السلم المختلفة اعتمادا على شدة الرنح في الفئران النموذجية. استخدمنا الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستقبل TH سلبي سائد على وجه التحديد في خلية Purkinje المخيخية ، وهي خلية عصبية وحيدة في القشرة المخيخية التي تعدل الأداء الحركي. نجح اختبار شعاع السلم الذي تم بناؤه حديثا في اكتشاف ضعف قوي في الأداء الحركي في الفئران المعدلة وراثيا على مستوى أكبر مقارنة باختبار الروتارد. كما تم الكشف عن اضطراب التعلم الحركي في اختبار شعاع السلم ولكن ليس في اختبار الروتارد. يمكن تطبيق البروتوكول مع هذا الجهاز السلوكي الجديد على نماذج حيوانية أخرى قد تظهر نمطا ظاهريا خفيفا للرنح لفحص التغيرات الطفيفة في وظيفة المخيخ.
Introduction
هرمون الغدة الدرقية (TH) لا غنى عنه لنمو الدماغ1. على وجه الخصوص ، دوره في المخيخ أمر بالغ الأهمية لأن نقص TH في الحياة المبكرة يسبب تطور المخيخ الشاذ 1,2. على سبيل المثال في قصور الغدة الدرقية الخلقي ، يظهر المرضى سلسلة من التخلف العصبي بما في ذلك العجز المعرفي والحركي3. للكشف عن دور TH في التطور الوظيفي للمخيخ ، حدت بعض الدراسات من نقص TH بطريقة خاصة بالخلايا المخيخية4. ومع ذلك ، بالمقارنة مع الفئران الخلقية المعممة ، حيث تتأثر جميع الأنسجة والخلايا بنقص TH ، فإن هذه النماذج الخاصة بالمخيخ تعرض ترنحا دقيقا لدرجة أن اختبارات السلوك التقليدية ، مثل اختبارات الروتارود والبصمة وشعاع التوازن ، بالكاد تكتشف الاختلافات. وبالتالي ، للتحقيق الكامل في تأثيرات TH على وظيفة المخيخ ، هناك حاجة إلى أداة تقييم جديدة للكشف عن تغيير طفيف في التنسيق الحركي للفئران النموذجية.
اختبار الروتارود هو الأداة الأكثر شيوعا لتقييم التنسيق الحركي ، الذي طوره في الأصل دنهام وميا5 وتم تطبيقه لاحقا على نسخة متسارعة بواسطة جونز وروبرتس6. يتم تفسير زمن الوصول للسقوط من القضيب الدوار على أنه اختبار للتنسيق الحركي ، كما أن بساطته وإيجازه يجعلانه شائع الاستخدام بين الباحثين السلوكيين الذين يدرسون الوظيفة الحركية7. ومع ذلك ، فإن سهولة استخدام هذا الاختبار هي سيف ذو حدين. نظرا لأن القضيب يدور تلقائيا ، يمكن للفئران التشبث بالقضيب الدوار والبقاء عليه دون أن تتحرك. علاوة على ذلك ، قد تنوي الفئران السقوط بدلا من الاستمرار في التوازن على القضيب الدوار. في كلتا الحالتين ، تكون صحة الاختبار وموثوقيته مشكوك فيها لتقييم “التنسيق الحركي الخالص”7. بمعنى آخر ، لا يستهدف بدقة وظيفة المخيخ ويتضمن عوامل أخرى مثل قوة العضلات للإمساك.
بدلا من الأدوات التقليدية لتقييم التنسيق الحركي ، نقدم هنا اختبارا سلوكيا جديدا يسمى “اختبار شعاع السلم” ، والذي تم تطويره مؤخرا في مختبرنا. تم تصميم اختبار المشي على السلم الأفقي لتقييم القدرات الحركية المعقدة المتعلقة بالمخيخ: التنبؤ بالتغذية الأمامية وتكامل الحركة8. يتكون جهاز الاختبار من أربع قطع من زجاج شبكي مع ثقوب (الشكل 1). تم توصيل الألواح الأربعة بالتوازي بواسطة مسامير وعصي يتم إدخالها في الثقوب الموجودة على الألواح. تم استخدام لوحين خارجيين لتثبيت الجهاز وتم استخدام لوحين داخليين لتصميم أنواع مختلفة من درجات السلم (الشكل 2C). تم تعديل عرض الدرجة اعتمادا على حجم لتقليل حركة للخلف (الشكل 2 ب). كانت المسافة من نقطة البداية إلى الهدف 110 سم. كان الجهاز موجودا على ارتفاع 60 سم فوق المقعد وتم وضع وسادة أمان أسفل الجهاز (الشكل 2 أ). تم وضع الغرفة المظلمة بالقرب من الهدف لتحفيز على التحرك نحو الهدف (الشكل 2 أ).
قمنا بفحص تأثيرات TH على التطور الوظيفي للمخيخ باستخدام الفئران المعدلة وراثيا التي تعبر عن مستقبلات TH السلبية السائدة (TR) في خلايا Purkinje المخيخية (الفئران Mf-1 / FVB). في كل من اختبارات شعاع الدوار والسلم ، لاحظنا النمط الظاهري الرنحي المخيخي في الفئران Mf-1 / FVB. ومع ذلك ، نجح اختبار شعاع السلم في اكتشاف اختلافات أكثر أهمية من اختبار الروتارود (الشكل 3). بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تقييم قدرة التعلم الحركي بشكل أكثر شمولا في اختبار شعاع السلم (الشكل 3B ، C). كخلفية خلوية لمثل هذا النمط الظاهري السلوكي ، تم تثبيط تحريض الاكتئاب طويل المدى (LTD) وبدلا من ذلك ، تم تحفيز التقوية طويلة المدى (LTP) بعد التحفيز الاستقرائي LTD في خلايا Mf-1 / FVB Purkinje9. LTD ضروري للتنسيق الحركي والتعلم الحركي في المخيخ10. أبلغت العديد من الدراسات عن عجز حركي وتثبيط LTD في الفئران بالضربة القاضية أو المتحورة للجينات المنظمة الرئيسية في وظيفة المخيخ ، ومع ذلك ، لم تبلغ أي دراسات عن تحريض LTP بعد التحفيز الاستقرائيLTD 11,12. مجتمعة ، قد تكون هذه الظاهرة فريدة من نوعها للفئران Mf-1 / FVB أو الفئران التي تعاني من نقص TH (لوحظت نفس الظاهرة في الفئران التي بدأت في بداية الغدة الدرقية للبالغين) ، مما يشير إلى أن TH ينظم وظيفة المخيخ بشكل مختلف عن البروتينات الرئيسية الأخرى. إذا كان الأمر كذلك ، فمن المعقول أن الفئران ذات تأثير TH غير الطبيعي لا تظهر ترنح المخيخ بنفس الطريقة مثل الفئران النموذجية الأخرى. هذا يؤكد مرة أخرى على الحاجة إلى طريقة محددة لتقييم آثار TH على وظيفة المخيخ. تقدم هذه الورقة بروتوكولا جديدا للتحقيق في تأثيرات TH على وظيفة المخيخ باستخدام اختبار شعاع السلم الذي تم بناؤه حديثا.
Protocol
Representative Results
Discussion
اعتمد تصميمنا على الدراسة السابقة التي أجراها ميتز و Whishaw ، اللذان أبلغا عن فائدة “اختبار المشي على درجة السلم”13,14. لقد صمموا اختبار المشي على درجة السلم لتقييم المشي الماهر وقياس وضع الأطراف الأمامية والخلفية والخطوات والتنسيق بين الأطرا…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم KAKENHI (رقم المنحة 18H03379 إلى N.K. ، 21K15340 إلى I.A. و 22J11280 إلى A.N.).
Materials
| Air puff | DAISO | ||
| Aluminum sticks | CAINZ | 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval). | |
| Blutack | Bostik | ||
| Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each | |
| Screws | CAINZ |
Referencias
- Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
- Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
- Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17 (2010).
- Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
- Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
- Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
- Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342 (2022).
- Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
- Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119 (2022).
- Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
- Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
- Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
- Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
- Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
- Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
- Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118 (2021).
- Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010 (2022).
- Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
- Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).
