T4 Bakteriofag och E. coli interaktion i murintarmen: En prototypisk modell för att studera värd-bakteriofagdynamik in vivo

Bakteriofager, eller fager, är virus som infekterar och dödar bakterier med art- och stamnivåspecificitet¹. Fager spelar viktiga roller inom komplexa bakteriesamhällen som tarmmikrobiotan, där de har varit inblandade i att reglera populationsdynamik och driva bakteriell kondition². Under det senaste decenniet har det funnits ett förnyat intresse för fagforskning på grund av ökningen av antimikrobiellt resistenta patogener³ och potentialen för fagterapi som en alternativ behandlingsstrategi. Under de senaste åren har lytiska fagcocktails använts intravenöst med viss framgång vid allvarliga, antibiotikaresistenta bakteriella septiska infektioner hos människor ^3,4. Oral fagterapi har också föreslagits som ett potentiellt alternativ till antibiotika för att behandla tarminfektioner och inflammation. Dessutom har fager varit inblandade i framgången för fekala filtrattransplantationer (FFT), som är fekala mikrobiotapreparat som har filtrerats för att avlägsna bakterier, vid behandling av återkommande Clostridioides difficile-infektion (rCDI)^5,6, inflammatoriska tarmsjukdomar (IBD)^7,8 och nekrotiserande enterokolit hos för tidigt födda grisar⁹. Med tanke på dessa resultat är det viktigt att ta hänsyn till interaktioner både mellan fager och tarmmikrobiotan, och fager och däggdjursvärden, eftersom tillsats av nya fager i ett redan existerande samhälle kan ha indirekta effekter på samhället som helhet, och inte bara dess målbakterier ^2,10.

Studien av faginteraktioner med deras målbakterier in vitro har visat sig vara användbar för att förstå mekanismerna och effekterna av- och bakterieinteraktioner i tarmen. I denna miljö har det visats att Escherichia coli-specifika T4-fager av ordningen Caudovirales kräver immunglobulin (Ig)-liknande domäner belägna i högantigena yttre kapsidproteiner (Hoc) på virionytan för att fästa vid tarmslem¹¹. Dessutom har transwell-analyser visat att T4-fager kan interagera med epitelcellkulturer och translokera genom cellager genom makropinocytos^12,13. Dessa resultat stöder hypotesen att fager kan interagera med sin metazoiska värd, även om de är oförmögna att infektera eukaryota celler. Dessa modeller, även om de är användbara, saknar hela skalan av komplexa interaktioner som uppstår i ett tarmekosystem som krävs för en omfattande utforskning av den tredelade interaktionen mellan fager, bakterier och metazovärden.

Musmodeller är ett viktigt verktyg för att undersöka fager i komplexa miljöer. En önskvärd tillämpning av fagadministrering är som en alternativ strategi för att behandla antimikrobiellt resistenta infektioner eller patogener associerade med kroniska inflammatoriska sjukdomar, inklusive IBD. Ny litteratur tyder dock på att fagbeteende in vitro inte fullt ut representerar in vivo-funktioner. Buttimer et ^al.14 visade att en fagcocktail kunde utarma de riktade bakterierna i ett förenklat humant mikrobiotakonsortium in vitro, men kunde inte replikeras in vivo i gnotobiotiska möss koloniserade med samma bakterie-fagkonsortium. Dessutom, i ett konventionellt musmikrobiom, ledde T7-till selektiv utarmning av dess måltarmbakterier, även om gradvis återhämtning observerades över tid, vilket tyder på utvecklad resistens¹⁵. Andra studier har visat samexistens av oralt administrerade fager och deras bakteriestammar in vivo ^2,16. Utöver/bakterie-samexistens ledde fagadministrering till omfattande förändringar i den övergripande sammansättningen^{och funktionen av} mikrobiotasamhället^. Detta är relevant i sjukdomsmiljöer eftersom flera studier har funnit samband mellan ökad relativ förekomst av Caudovirales och IBD ^7,8,17 som var oberoende av förändringar i bakteriell förekomst⁷. Det är fortfarande okänt om detta är en drivkraft eller konsekvens av sjukdomspatogenesen.

Historiskt har fagforskningen fokuserat på relationen mellan en och dess målbakterie. Det är dock också viktigt att ta hänsyn till potentiella interaktioner mellan och slemhinnan, epitelet och immunsystemet hos den metazoiska värden. Dessa interaktioner spelar alla en viktig roll i det övergripande svaret på tarmfaginfektion. För att demonstrera detta har fager studerats med hjälp av bakteriefria (GF) möss för att belysa deras inverkan på immunsystemet utan inblandning av mikrobiotan⁸. I detta system detekterades fagnukleinsyror av toll-liknande receptorer (TLR) belägna i endosomer av fagocytiska immunceller (makrofager och dendritiska celler). Detta aktiverade nedströms signalering och stimulerade T-cellsberoende produktion av interferon (IFN)-γ⁸ eller typ I IFN¹⁸. Dessutom implicerade Fluckiger et ^al.19 minnes-CD8⁺ T-celler i igenkänningen av fagkodade (prophage) antigener, vilket resulterade i T-cellskorsreaktivitet med tumörantigener, vilket resulterade i minskad tumörbörda. Slutligen har fagspecifik antikroppsproduktion dokumenterats i musstudier där fager levererades till djurmodeller på ett kontinuerligt sätt genom dricksvatten ^8,20, eller genom upprepad oral sondmatning under flera månader²⁰, vilket visar fagproteinernas förmåga att främja humorala immunsvar. Även om dessa metoder för faginokulering möjliggör optimal och kontinuerlig priming av immunsystemet, kanske de inte representerar de naturligt förekommande interaktionerna mellan fager och tarmmiljön, eller kinetiken för oralt applicerad fagterapi. Hittills har ett begränsat antal studier undersökt fagens interaktioner med en enda bakterieart i monokoloniserade musmodeller²¹. Monokoloniserade möss visade sig dock vara avgörande för att dechiffrera mikrobspecifika effekter av enskilda arter på mag-tarmkanalen (GI) och immunutveckling 22,23,24, och de kan fortfarande visa sig vara användbara för att förstå tredelade interaktioner mellan fager, deras målbakterier och den metazoiska värden.

Spännande nog finns det fortfarande mycket att lära om samspelet mellan tarmfag och tarmkommensala bakterier, liksom de interaktioner som sker mellan metazovärden och fagerna som finns i den. Detta protokoll tillhandahåller en uppsättning procedurer för att studera isolerad T4-och dess bakteriella motsvarighet, E. coli (K-12, BW25113), med hjälp av en gnotobiotisk musmodell. Dessa standardiserade procedurer ger också en grund för att optimera andra/bakteriedyader genom att anpassa tillväxtparametrarna till de intressanta paren. De metoder som beskrivs här beskriver: (1) Beredning av T4-och vehikellysat för oral sondmatning av möss; (2) Oral administrering av T4-till E. coli monokoloniserade gnotobiotiska möss; (3) Övervakning av T4-fagnivåer i avföring och vävnad från möss över tid.

För de representativa resultaten som presenteras här förökades renade T4-faglysat från fagbankslager som underhålls av Rohwer Lab. -på-kran-metoden för förökning av T4-anpassades²⁵, som refereras till i detta protokoll. Metoden ger högtiter, endotoxin-låga faglager inom tre dagar. Med hjälp av detta tillvägagångssätt samlades rutinmässigt 10 ml ≥ 10¹⁰ plackbildande enheter (pfu)/ml T4-med < 0,5 endotoxinenheter (EU)/ml. De rekommenderade endotoxinnivåerna för oral eller intravenös administrering till möss är ≤ 20 EU/ml respektive ≤ 5 EU/kg/timme (eller 0,1 EU administrerat under 1 timme för en mus på 20 g), vilket gör detta till en lämplig metod för fagberedning för inokulering in vivo . Alla faglager förvarades vid 4 °C i fagbuffert med saltlösning av magnesium (SM) (recept finns i steg 1.1.5.1). E. coli odlades i LB media. För olika-bakteriepar kan olika odlingssubstrat och tillväxtförhållanden anpassas från detta protokoll. Fager kan också hämtas från miljön, såsom avloppsvatten, havsvatten, jord och tarminnehåll och kan isoleras och renas enligt Sambrook och Russell²⁶ före beredning med lämpliga tillväxt- och förökningsförhållanden för varje-värdpar av intresse²⁵. Alternativt kan fager erhållas från kommersiella källor (se Materialförteckning) eller från fagbanker.