Generación de un sistema de cultivo monocapa bidimensional derivado de enteroide primario bovino para aplicaciones en investigación biomédica traslacional

Todos los protocolos se realizaron cumpliendo con los lineamientos y regulaciones institucionales y nacionales para el bienestar animal. 1. Preparación de reactivos NOTA: El stock y las concentraciones finales de los reactivos utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1. Prepare el tampón de recolección de muestras: Mezcle 1 litro de solución salina tamponada con fosfato (PBS) helada que contenga penicilina (100 U/mL), estreptomicina (100 μg/mL), gentamicina (25 μg/mL) y caspofungina (2,5 μg/mL). Almacenar solución madre a 4 °C. Preparar el reactivo de disociación #1: Mezclar 18,55 ml de tampón de recogida de muestras (como se describe en el paso 1.1), 1,422 ml de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, 0,422 M/pH 7,4), 20 μl de solución 1 M de 1,4-ditiotreitol (DTT), 4 μl de solución de Y-27632 (5000x/50 mM). Almacenar la solución a 4 °C. Prepare el reactivo de disociación #2: Mezcle 18,57 ml de tampón de recolección (como se describe en el paso 1.1), 1,422 ml de EDTA (0,422 M/pH 7,4), 4 μl de solución de Y-27632 (5000x/50 mM). Almacenar la solución a 37 °C. Prepare el stock de sustrato enteroide: Mezcle 9,875 ml de medio de crecimiento organoide más suplemento, 100 μl de penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml), 5 μl de gentamicina (25 μg/ml) y 20 μl de caspofungina (2,5 μg/ml). Almacenar la solución a 4 °C. Prepare el material de medios de diferenciación de enteroides: Mezcle 10 ml de medio de diferenciación de organoides más suplemento, 100 μl de penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml), 5 μl de gentamicina (25 μg/ml) y 20 μl de caspofungina (2,5 μg/ml). Almacenar la solución a -20 °C. Prepare los medios de lavado: Mezcle 48,45 ml de medio DMEM/F-12 1,1 (con L-glutamina, sin HEPES), 1 ml de suplemento B-27 sin vitamina A (50 veces el caldo), 500 μl de penicilina (100 U/ml), estreptomicina (100 μg/ml), 25 μl de gentamicina (50 mg/ml de stock) y 25 μl de caspofungina (5 mg/ml de stock). Almacenar la solución a 4 °C. Preparar el tampón de recubrimiento: Mezclar 25 mL de DMEM: F12 medio completo sin inhibidores y 25 mg de albúmina sérica bovina (BSA). Almacenar la solución a 4 °C. 2. Aislamiento de las criptas intestinales del tejido entero (Figura 1) NOTA: Los enteroides del intestino delgado bovino se generaron a partir de tejido ileal obtenido de novillos Holstein adultos sanos (>2 años de edad) de una planta local de procesamiento de carne de res. Se utilizó un donante para esta serie de experimentos. Preparación de muestras de tejido intestinalColoque las muestras de tejido intestinal recolectadas de ~ 10 pulgadas (25 cm) en ~ 400 ml de tampón de recolección helado (PBS + antibióticos / antimicóticos) y en hielo para transportarlas al laboratorio. Con tijeras quirúrgicas (p. ej., tijeras de mayonesa) y fórceps (p. ej., pinzas de adson), elimine el exceso de grasa y mesenterio de la muestra de tejido intestinal. Corta el pañuelo en dos trozos iguales. Abra el tejido longitudinalmente con unas tijeras quirúrgicas y enjuague el tejido en PBS estéril. Retire suavemente la capa de moco de la muestra intestinal utilizando el costado de un portaobjetos de microscopio de vidrio estéril y enjuague el tejido con PBS fresco.NOTA: Este paso ayuda a eliminar las vellosidades y ayuda a aumentar la pureza de las fracciones de la cripta en los pasos posteriores. Por cada pieza de 13 cm (5 pulgadas), corta el tejido en dos de 6,5 cm (2,5 pulgadas) y luego corta cada pieza en 4 piezas pequeñas aproximadamente iguales para facilitar la disociación del tejido. Disociación del tejido intestinalPrepare un volumen de 20 mL del reactivo de disociación tisular #1 en un tubo cónico estéril de 50 mL y deposite las pequeñas muestras de tejido en el tubo cónico hasta que el desplazamiento de volumen mueva el menisco de la marca de 20 mL a la marca de 35 mL en el tubo cónico. Repita el paso anterior para las piezas restantes de la muestra de tejido del intestino delgado. Selle los tubos cónicos con parafilm y agite manualmente el tubo cónico 10 veces.NOTA: A lo largo del protocolo, la agitación manual debe realizarse de manera deliberada pero suave. Coloque los tubos cónicos horizontalmente sobre hielo en un recipiente sobre una plataforma de agitación orbital. Agite los tubos cónicos sobre hielo en el recipiente durante 30 minutos a 80 revoluciones por minuto (rpm). Cada 10 minutos, agite manualmente el tubo cónico. Prepare un volumen de 20 ml de reactivo de disociación tisular #2 precalentado (37 °C) (formulado como el anterior, pero sin TDT) en un tubo cónico de 50 ml. Deposite las muestras de tejido de los tubos cónicos que contienen el reactivo de disociación #1 en los tubos cónicos que contienen el reactivo de disociación #2. Selle los tubos cónicos con parafilm y agite manualmente los tubos cónicos 10 veces. Coloque los tubos cónicos en un baño de agua agitado precalentado (37 °C), inclinado en un ángulo de aproximadamente 60 °C, y agite a 150 rpm durante 10 minutos, agitando manualmente después de 5 minutos y nuevamente después de los 10 minutos totales de incubación. Aislamiento de fragmentos de criptaEtiquete 10 tubos cónicos estériles #1 – #10. Agregue 20 ml de PBS estéril helado a cada tubo cónico etiquetado. Transfiera los trozos de tejido de los tubos cónicos que contienen el reactivo de disociación #2 a un nuevo tubo cónico estéril de 50 ml que contenga PBS #1 helado. Agite manualmente los tubos cónicos 10 veces. Selle los tubos cónicos con parafilm y colóquelos horizontalmente sobre hielo. Agite los tubos cónicos en un agitador orbital durante 10 minutos a 80 rpm. Después de 10 minutos, agite manualmente el tubo cónico #1 10 veces. Esto se considera Lavado #1. Transfiera suavemente las muestras de tejido con un par de pinzas quirúrgicas al tubo cónico # 2. Repita los pasos 2.3.2 – 2.3.4, esto se considera Lavado # 2. Repita los lavados hasta el lavado # 10. Los sobrenadantes de cada lavado contienen las criptas que se utilizarán para la generación de enteroides. Mantenga los tubos que contienen los sobrenadantes a 4 °C hasta que se completen los 10 lavados. Una vez finalizado el10º lavado y desechada la sección de tejido, centrifugar los sobrenadantes de los tubos cónicos #6-#10 a 400 x g durante 2 min a 4 °C para granular las criptas aisladas.NOTA: Los lavados 6-10 contienen las fracciones más limpias de criptas intactas con escombros limitados y células individuales. Como tal, se recomienda que solo se usen estas fracciones para la generación de enteroides, y que se descarten los lavados anteriores (#2-#5) Deseche el sobrenadante y agregue 4 ml de PBS fresco y helado a las criptas sin volver a suspender (esto ayuda a mantener los fragmentos intactos hasta la microscopía). Evaluar la pureza de las criptas disociadas para cada tubo cónico #6-#10 mediante microscopía.Agregue 50 μL de PBS a una placa de 384 pocillos. Agregue 10 μL de suspensión de cripta al PBS y use una lente de objetivo de aumento de 40x para determinar la pureza, integridad y recuento de criptas.NOTA: Dibujar una cruz en la parte inferior del plato facilita el conteo. 3. Generación y paso ex vivo de enteroides ileales bovinos (Figura 2) NOTA: Las criptas de los tubos cónicos con las criptas intestinales más puras e intactas se utilizarán para ensayos posteriores. Para todos los pasos que involucran criptas y enteroides, las puntas de pipeta, los raspadores celulares y los tubos deben recubrirse previamente con el tampón de recubrimiento, y se deben evitar las burbujas para evitar la pérdida de criptas. A menos que se indique lo contrario, se debe utilizar una punta de pipeta de 1000 μL para evitar la ruptura de los fragmentos de la cripta. Generación de enteroides a partir de fragmentos de criptaCombine las fracciones de cripta más puras (generalmente # 6-# 10) en un tubo cónico. Centrifugar el tubo cónico que contiene las criptas a 400 x g durante 2 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante aspirándolo con una pipeta y vuelva a suspender el gránulo de cripta en el medio de lavado. Centrífuga como en el paso 3.1.2. Decantar el sobrenadante y añadir 2 ml de Wash Media al gránulo de la cripta. Cuente el número de criptas como se describe en el paso 2.3.11.1. Centrifugar como en el paso 3.1.2 para granular las criptas, desechar el sobrenadante y volver a suspender en una matriz extracelular (BME) de membrana basal con factor de crecimiento reducido al 100% para lograr una concentración de aproximadamente 400 criptas/100 μL.NOTA: es importante descongelar correctamente el BME a 4 °C, ya que los cambios de temperatura alteran su consistencia. Se puede evitar que el BME se solidifique prematuramente utilizando un bloque de enfriamiento y puntas de pipeta preenfriadas.El uso de otra formulación de matriz de membrana basal puede requerir la dilución del BME al crear domos. Consulte las instrucciones del fabricante específicas para el BME que se está utilizando. Pipetea hacia arriba y hacia abajo para suspender completamente las criptas en el BME. Realice domos crypt-BME pipeteando lentamente 50 μL de suspensión crypt-BME en una placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos en una placa de calentamiento ajustada a 37 °C con hasta 8 domos/pocillo.NOTA: La placa de 6 pocillos debe precalentarse en una incubadora a 37 °C durante la noche antes de la siembra de los domos. Mantenga la placa de 6 pocillos en la placa de calentamiento durante 1 minuto antes de mover con cuidado la placa a una incubadora de 37 °C y 5% deCO2 . Después de 2 minutos, voltee la placa de 6 pocillos para que la tapa quede hacia abajo e incube durante 30 minutos más para permitir que las cúpulas se polimericen. Después de 30 minutos, agregue con cuidado 3 ml de medio de crecimiento enteroide a temperatura ambiente (RT) suplementado con 10 μM de SB202190, 0,5 μM de LY2157299 y 10 μM de Y-27632 a los pocillos que contienen domos. Incubar a 37 °C, 5% CO2. Retire el medio y reemplácelo con un medio de crecimiento enteroide fresco suplementado con inhibidores cada 2-3 días. Pasaje de enteroidesDespués de 7-10 días, asegúrese de que las criptas hayan formado enteroides 3D con muchas estructuras en ciernes, como en la Figura 2E, y estén listas para ser transitadas. Deseche los medios de los pozos que contienen domos. Por cada 4 domos por pocillo, agregue 1 ml de solución helada de disociación celular no enzimática suplementada con 10 μM Y-27632 a cada pocillo que contenga domos. Con un raspador celular prerrecubierto, separe suavemente la cúpula de la placa de cultivo de tejidos. Recoja los enteroides en un tubo cónico de 15 ml y triture pipeteando hacia arriba y hacia abajo 10 veces. Incubar el tubo cónico que contiene los enteroides fragmentados a RT en un agitador orbital a 80 rpm durante 10 min. Agregue 10 ml de medios de lavado helados con 10 μM Y -27632 a los enteroides. Centrifugar el tubo cónico a 300 x g durante 5 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 10 ml de medios de lavado nuevos y transfiéralo a un nuevo tubo cónico de 15 ml. Centrifugar el tubo cónico a 300 x g durante 5 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de medio de crecimiento enteroide en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar el tubo de microcentrífuga a 300 x g durante 5 min a RT y desechar el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo enteroide en BME 100% frío como hielo y siga los pasos 3.1.6-3.1.13. Volver a pasar enteroides cada 7 días. Los tiempos de expansión pueden variar debido a la densidad, viabilidad y extensión de la brotación. Múltiples estructuras en ciernes que crean grandes estructuras enteroides son indicativas de que los enteroides necesitan ser pasados. Criopreservación de enteroidesPara la criopreservación, asegúrese de que los enteroides no pasen más de cinco veces en cultivo.NOTA: Esto no ha sido probado experimentalmente y se basa en la observación de los autores de que los pasajes posteriores han reducido la viabilidad y producen resultados variables. Para recolectar los enteroides, utilice el tampón de disociación como se describe en los pasos 3.2.2-3.2.9.NOTA: Disocie mecánicamente los enteroides con una pipeta de 5 ml. Cuente el número de fragmentos enteroides como se describe en el paso 2.3.11.1. Centrifugar el tubo cónico a 300 x g durante 5 min a RT. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender los fragmentos de enteroides en medios de criopreservación suplementados con 10 μM Y-27632 para lograr una concentración de ~2000 fragmentos de enteroides/mL y una alícuota de 1 mL en crioviales premarcados. Coloque los crioviales en un recipiente de congelación controlada y guárdelos a -80 °C durante la noche. Transfiera los crioviales a nitrógeno líquido en fase de vapor para su almacenamiento a largo plazo. Reanimación de fragmentos de criptas intestinalesColoque una placa de 6 pocillos durante la noche dentro de la incubadora. Revise previamente un tubo de 5 ml con 5 ml de medio de recubrimiento. Retire los crioviales del almacenamiento de nitrógeno líquido. Inmediatamente, una vez descongelados, transfiera las criptas del criovial al tubo de 5 ml prerrevestido. Enjuague el criovial con medios de lavado y agréguelo al tubo de 5 ml. Evite las burbujas. Lleve el volumen hasta 5 ml con medios de lavado y centrifugue a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Durante la centrifugación, recubra previamente un tubo de 1,5 ml con medios de recubrimiento. Después de la centrifugación, vierta el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en el medio que queda en el tubo y transfiéralo al tubo de 1,5 ml prerrevestido. Lave el tubo de 5 ml con medios de lavado y transfiéralo a un tubo de 1,5 ml. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C. Aumente el volumen a 1,5 ml con los medios de crecimiento enteroides. Centrifugar como se indicó anteriormente (paso 3.4.7) y aspirar con cuidado. Tomar BME a partir de 4 °C y colocar sobre hielo/bloque de hielo. Vuelva a suspender el gránulo enteroide en BME 100% helado y siga los pasos 3.1.6- 3.1.12. Cambie los medios cada 2-3 días. 4. Generación y evaluación de monocapas 2D a partir de enteroides 3D NOTA: Al igual que en el caso anterior, para todos los pasos que impliquen criptas y enteroides, las puntas de pipeta, los raspadores celulares y los tubos deben recubrirse previamente con el tampón de recubrimiento, y deben evitarse las burbujas para evitar la pérdida de criptas. Preparación de insertos transwell para la formación de monocapas 2DColoque los insertos en una placa adaptadora de cultivo de tejidos de 24 pocillos y recubra previamente el lado apical de los insertos de cultivo celular PET de 1 μm de 24 pocillos con 100 μL de dilución 1:15 de BME en medios de crecimiento enteroides. Cubra siempre un inserto adicional que se utilizará como control al tomar medidas de integridad de la barrera. Coloque el inserto recubierto en una placa adaptadora de cultivo de tejidos de 24 pocillos en la incubadora.NOTA: Se debe utilizar un adaptador específico o una placa de cultivo de tejidos complementaria con los insertos transwell. Incubar los insertos de cultivo a 37 °C, 5% CO2 durante 1 h para permitir la polimerización.NOTA: Los transpocillos recubiertos de BME pueden sellarse con parafilm y almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana si no se utilizan inmediatamente. Al final de la incubación, aspire el medio de cultivo enteroide 3D. Disociación de enteroides 3DGenere monocapas de enteroides 2D a partir de fragmentos de enteroides criopreservados que fueron resucitados, plateados y cultivados como se describe anteriormente en la sección 3.1 para formar enteroides 3D. Pasar los enteroides descongelados al menos dos veces, con el último paso cultivado durante un mínimo de 5 días antes del procesamiento para generar cultivos monocapa 2D. Coseche los enteroides agregando medios de lavado helados suplementados con 10 μM Y-27632 a los domos de enteroides (use aproximadamente 1 ml de tampón de disociación para 4 domos) Separe los domos con un raspador de células y recójalos en un tubo cónico de 15 ml. Triturar 30 veces con una punta de pipeta de 1 ml para generar fragmentos enteroides. Triturar 40 veces con una punta de pipeta de 200 μL para romper aún más los fragmentos enteroides. Lleve el volumen del tubo cónico de 15 ml con fragmentos enteroides a 10 ml con medios de lavado helados. Centrifugar el tubo cónico a 300 x g durante 5 min a RT. Aspirar el sobrenadante, incluida la capa de BME, teniendo cuidado de no alterar el gránulo enteroide.NOTA: La capa BME aparecerá como una capa gelatinosa turbia justo encima del gránulo. Por cada 4 domos, resuspender el gránulo en 1 mL de enzima TrypLE express precalentada suplementada con 10 μM de Y-27632. Añadir la mezcla de enteroide y triplito a una placa de 24 pocillos e incubar a 37 °C, 5% de CO2 durante 10 min. Después de 10 minutos, pipetear la mezcla de enteroide y triplito 40 veces con una pipeta de 1 ml para fragmentar aún más los enteroides. A continuación, pipetea los fragmentos 40 veces con una pipeta de 200 μL para romper los fragmentos en células individuales. Usando una jeringa de 3 ml o 5 ml con una aguja estéril de 22 g conectada, aspire y dispense la suspensión celular 4 veces para lograr la suspensión de una sola célula. Monitorizar la disociación celular mediante microscopía como se describe en el paso 2.3.11.1, hasta que el 80% de los enteroides se descompongan en células individuales. Recoja la suspensión celular en un tubo cónico de 15 ml y apague la reacción enzimática agregando 4 veces el volumen de medios de lavado suplementados con FBS al 10%. Filtre los enteroides a través de un filtro de células de 40 μm prerrecubierto dos veces en un tubo cónico de 50 ml. Granular las células individuales centrifugando el tubo cónico a 300 x g durante 5 min. Siembra monocapa 2D en insertos transwell.Decantar el sobrenadante y resuspender el gránulo en un pequeño volumen (~600 μL) de medio de crecimiento organoide suplementado con un 20% de suero fetal bovino (FBS) a RT. Determine la densidad y la viabilidad de las células enteroides utilizando el método de exclusión de colorante azul de tripano, el hemacitómetro o el contador celular automatizado. Se espera una viabilidad media del 75%. Retire con cuidado el exceso de solución de recubrimiento aplicado en el paso 1.3 del inserto de cultivo celular justo antes de sembrar las células. Siembre las células individuales en 1 x 105 células en un volumen de 200 μL por inserto en la superficie apical de un inserto de cultivo celular prerrecubierto. Añadir 700 μL de medio completo suplementado con FBS al 20% en el lado basolateral del inserto de cultivo celular. Maniobre la placa 10 veces en forma de número 8 para permitir que las celdas se extiendan uniformemente sobre el inserto. Mantenga la placa en el calentador de platos durante 10 minutos en el gabinete de bioseguridad. Incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2. Después de 48 h, reemplace los medios en los compartimentos apical y basal con medios de crecimiento enteroide frescos suplementados con FBS al 20% e inhibidores. Al tercer día, retire el medio de los compartimentos apical y basolateral, lave cuidadosamente el inserto con 1x PBS y reemplácelo con un medio de diferenciación enteroide complementado solo con inhibidores. Cambie los medios en ambos compartimentos cada 2-3 días. Medición cuantitativa de la integridad de la barrera epitelial y la confluencia de la monocapaNOTA: La integridad de la barrera se puede evaluar mediante el uso de un voltohmímetro epitelial para medir la resistencia eléctrica transepitelial (TEER).Retire la placa de cultivo transwell de la incubadora y deje que se equilibre a RT durante unos minutos en la cabina de bioseguridad. Asegúrese de que los electrodos STX2 hayan sido preacondicionados y calibrados con el voltohmetro a 1000 Ω según las instrucciones del fabricante. Inserte el palo largo de la sonda en el compartimiento basolateral y el extremo corto en el compartimiento apical del cultivo de células epiteliales transpocillo. Tenga cuidado de no romper la monocapa ni dañar el inserto. Una vez estable, registre 3 mediciones de TEER por inserto transpocillo, incluido el inserto sin células. Tome un promedio de las medidas de cada inserto. Calcule el valor de TEER corregido restando la medida promedio del pozo en blanco de las mediciones promedio de los pozos experimentales y luego multiplicándolo por el área de superficie del inserto para determinar la resistencia de la barrera epitelial (TEER [Ω.cm2] = [Rcell layer – Rblank] × Area).