Imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello dopo emorragia subaracnoidea
Summary
L’indagine preliminare conferma che l’emorragia subaracnoidea (SAH) provoca la morte dei periciti cerebrali. La valutazione della contrattilità dei periciti post-SAH richiede la differenziazione tra periciti cerebrali vitali e non vitali. Pertanto, è stata sviluppata una procedura per etichettare i periciti cerebrali vitali e non vitali contemporaneamente nelle sezioni cerebrali, facilitando l’osservazione utilizzando un microscopio confocale ad alta risoluzione.
Abstract
I periciti sono cellule murali cruciali situate all’interno della microcircolazione cerebrale, fondamentali per modulare attivamente il flusso sanguigno cerebrale attraverso aggiustamenti della contrattilità. Convenzionalmente, la loro contrattilità viene misurata osservando i cambiamenti morfologici e i cambiamenti del diametro capillare nelle vicinanze in circostanze specifiche. Tuttavia, la fissazione post-tissutale, la valutazione della vitalità e la conseguente contrattilità dei periciti cerebrali vengono compromessi. Allo stesso modo, l’etichettatura genetica dei periciti cerebrali non è in grado di distinguere tra periciti vitali e non vitali, in particolare in condizioni neurologiche come l’emorragia subaracnoidea (SAH), dove la nostra indagine preliminare convalida la morte dei periciti cerebrali. È stato messo a punto un protocollo affidabile per superare questi vincoli, consentendo l’etichettatura fluorescente simultanea di periciti cerebrali funzionali e non funzionali nelle sezioni cerebrali. Questo metodo di marcatura consente la visualizzazione al microscopio confocale ad alta risoluzione, marcando contemporaneamente la microvascolarizzazione della fetta di cervello. Questo protocollo innovativo offre un mezzo per valutare la contrattilità dei periciti cerebrali, il suo impatto sul diametro capillare e sulla struttura dei periciti. Lo studio della contrattilità dei periciti cerebrali all’interno del contesto SAH fornisce una comprensione approfondita dei suoi effetti sulla microcircolazione cerebrale.
Introduction
I periciti cerebrali, che si distinguono per le loro sottili protuberanze e corpi cellulari sporgenti, circondano il microcircolo 1,2. Mentre l’aumento del flusso sanguigno cerebrale è prevalentemente guidato dalla dilatazione capillare, le arterie più piccole mostrano tassi di dilatazione più lenti3. La contrattilità dei periciti esercita un’influenza sul diametro dei capillari e sulla morfologia dei periciti, influenzando la dinamica vascolare4. La contrazione dei periciti cerebrali porta alla costrizione capillare e, in scenari patologici, una contrazione eccessiva può ostacolare il flusso eritrocitario5. Vari fattori, tra cui la noradrenalina rilasciata dal locus coeruleus, possono indurre la contrazione dei periciti cerebrali all’interno dei capillari6. Con un ruolo regolatore nel flusso sanguigno cerebrale, i periciti mostrano la sintesi di 20-HETE, fungendo da sensore di ossigeno durante l’iperossia7. La contrazione dei periciti cerebrali innescata dallo stress ossidativo-nitrativo influisce negativamente sui capillari5. Nonostante le indagini sia in vivo che ex vivo sulla contrazione dei periciti cerebrali8, persistono conoscenze limitate per quanto riguarda l’imaging dei periciti cerebrali vitali e non vitali all’interno di fette di cervello.
Fondamentalmente, l’imaging post-fissazione tissutale dei periciti cerebrali compromette la loro vitalità e la successiva valutazione della contrattilità. Inoltre, in scenari come i disturbi neurologici (ad esempio, l’emorragia subaracnoidea – SAH), la marcatura transgenica dei periciti cerebrali non riesce a distinguere tra periciti vitali e non vitali, come confermato dal nostro studio preliminare sulla morte dei periciti cerebrali indotta da SAH9.
Per superare queste sfide, abbiamo impiegato TO-PRO-3 per marcare i periciti vivi, mentre quelli deceduti sono stati colorati con ioduro di propidio (PI). Abbiamo utilizzato tecnologie di imaging confocale ad alta risoluzione per visualizzare i periciti cerebrali vitali e non vitali nelle fette di cervello, preservando l’attività della fetta durante l’imaging. Questo articolo ha lo scopo di presentare un metodo riproducibile per l’imaging di periciti cerebrali vitali e non vitali in fette di cervello, fungendo da prezioso strumento per sondare l’impatto dei periciti cerebrali sulla microcircolazione cerebrale dopo SAH.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sono state sviluppate tecniche di imaging confocale ad alta risoluzione per la visualizzazione dei periciti cerebrali vitali, dei periciti cerebrali non vitali e della microvascolarizzazione in fette di cervello. Nelle fette acute di cervello di ratto, il processo comporta la marcatura iniziale dei periciti con TO-PRO-311, seguita da cellule endoteliali microvascolari con IB412; successivamente, l’identificazione dei periciti deceduti viene condotta utilizzando PI. Questo p…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Lo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81960226,81760223); la Fondazione di Scienze Naturali della Provincia dello Yunnan (202001AS070045,202301AY070001-011)
Materials
| 6-well plate | ABC biochemistry | ABC703006 | RT |
| Adobe Photoshop | Adobe | Adobe Illustrator CS6 16.0.0 | RT |
| Aluminium foil | MIAOJIE | 225 mm x 273 mm | RT |
| CaCl2·2H2O | Sigma-Aldrich | C3881 | RT |
| Confocal imaging software | Nikon | NIS-Elements 4.10.00 | RT |
| Confocal Laser Scanning Microscope | Nikon | N-SIM/C2si | RT |
| Gas tank (5% CO2, 95% O2) | PENGYIDA | 40L | RT |
| Glass Bottom Confocal Dishes | Beyotime | FCFC020-10pcs | RT |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G5767 | RT |
| Glue | EVOBOND | KH-502 | RT |
| Ice machine | XUEKE | IMS-20 | RT |
| Image analysis software | National Institutes of Health | Image J | RT |
| Inhalation anesthesia system | SCIENCE | QAF700 | RT |
| Isolectin B 4-FITC | SIGMA | L2895–2MG | Store aliquots at –20 °C |
| KCl | Sigma-Aldrich | 7447–40–7 | RT |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P0662 | RT |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M7506 | RT |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647–14–5 | RT |
| NaH2PO4·H2O | Sigma-Aldrich | 10049–21–5 | RT |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | RT |
| Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318314 | RT |
| Peristaltic Pump | Scientific Industries Inc | Model 203 | RT |
| Propidium (Iodide) | Med Chem Express | HY-D0815/CS-7538 | Store aliquots at –20 °C |
| Stereotaxic apparatus | SCIENCE | QA | RT |
| Syringe pump | Harvard PUMP | PUMP 11 ELITE Nanomite | RT |
| Thermostatic water bath | OLABO | HH-2 | RT |
| Vibrating microtome | Leica | VT1200 | RT |
Referencias
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