Une approche globale pour analyser les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux
Summary
Cette étude décrit une méthode rapide et efficace pour l’analyse des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux par la dissolution des caillots, la coloration cellulaire et l’examen sanguin de routine.
Abstract
La thrombose cérébrale, un caillot sanguin dans une artère ou une veine cérébrale, est le type d’infarctus cérébral le plus courant. L’étude des composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux est importante pour le diagnostic, le traitement et le pronostic. Cependant, les approches actuelles pour étudier les composants cellulaires des caillots sont principalement basées sur la coloration in situ , ce qui ne convient pas à l’étude complète des composants cellulaires car les cellules sont étroitement enveloppées dans les caillots. Des études antérieures ont réussi à isoler une enzyme fibrinolytique (sFE) de Sipunculus nudus, qui peut dégrader directement la fibrine réticulée, libérant les composants cellulaires. Cette étude a permis d’établir une méthode complète basée sur la sFE pour étudier les composants cellulaires du thrombus cérébral. Ce protocole comprend la dissolution du caillot, la libération des cellules, la coloration des cellules et l’examen sanguin de routine. Selon cette méthode, les composants cellulaires pourraient être étudiés quantitativement et qualitativement. Les résultats représentatifs des expériences utilisant cette méthode sont présentés.
Introduction
Les maladies cérébrovasculaires sont l’une des trois principales maladies qui peuvent menacer la santé humaine, parmi lesquelles les maladies cérébrovasculaires ischémiques représentent plus de 80%. La thrombose cérébrale et la thrombose veineuse cérébrale sont les maladies cérébrovasculaires ischémiques les plus concernées aujourd’hui, principalement causées par des caillots sanguins cérébraux 1,2. Si le traitement n’est pas effectué correctement, il aura des taux élevés d’invalidité et de mortalité et un taux de récidive élevé après la sortie3.
Récemment, un nombre croissant d’études ont montré que les composants cellulaires des caillots sanguins cérébraux sont étroitement corrélés au diagnostic, au traitement et au pronostic de la thrombose cérébrale 4,5,6. Par conséquent, la disponibilité de données sur la composition du thrombus, en particulier les composants cellulaires, est importante pour le diagnostic clinique et le traitement. Malheureusement, les méthodes actuellement disponibles ne permettent pas d’analyser de manière exhaustive le composant du caillot sanguin quantitativement et qualitativement. Par exemple, la coloration in situ basée sur Martius Scarlett Blue ne peut étudier que les globules rouges/blancs de certaines tranches du caillot7. La coloration in situ basée sur l’immunohistochimie (IHC) ne permet d’étudier que des composants sanguins limités de certaines tranches du caillot à l’aide de leurs anticorps8. Les méthodes basées sur l’imagerie microscopique ne s’intéressent qu’à la structure spécifique du caillot9. De plus, toutes ces méthodes sont laborieuses et chronophages10. À ce jour, les procédures permettant d’étudier quantitativement et qualitativement les composants des cellules des thrombus cérébraux n’ont pas été rapportées. Il est largement reconnu que la fibrine réticulée enveloppe étroitement les cellules sanguines dans les caillots11. Par conséquent, la dégradation spécifique de la fibrine réticulée et la libération des cellules intactes sont essentielles pour l’analyse précise des composants cellulaires.
Des travaux antérieurs ont isolé une enzyme fibrinolytique de Sipunculus nudus (sFE), qui peut dégrader la fibrine de manière spécifique et rapide12. Ici, une méthode d’analyse des composants cellulaires des thrombus cérébraux basée sur l’activité unique de la sFE a été proposée. Ce protocole a utilisé la sFE pour dégrader d’abord la fibrine des caillots, puis a analysé les composants cellulaires par coloration de Wright et examen sanguin de routine13,14. Selon cette méthode, les composants cellulaires des thrombus cérébraux peuvent être étudiés quantitativement et qualitativement. Ce protocole simple et efficace pourrait être appliqué pour l’analyse des composants cellulaires d’autres caillots sanguins.
Protocol
Representative Results
Discussion
La sFE est un agent fibrinolytique qui peut dégrader la fibrine directement et efficacement12,16. Ici, la sFE a été utilisée pour dégrader la fibrine réticulée des caillots sanguins cérébraux, libérer les cellules enfermées dans les caillots et analyser qualitativement et quantitativement les composants cellulaires des caillots. Les données microscopiques et l’examen sanguin de routine ont indiqué que les cellules enfermées avaient été libérée…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée par le Bureau des sciences et de la technologie de la ville de Xiamen (3502Z20227197) et le Bureau des sciences et de la technologie de la province du Fujian (n° 2019J01070, n° 2021Y0027).
Materials
| Agglutination Reaction Plate | ROTEST | RTB-4003 | |
| Auto Hematology Analyzer | SYSMEX | XNB2 | |
| Automatic Vertical Pressure Steam Sterilizer | SANYO | MLS-3750 | |
| Centrifuge Tube (1.5 mL) | Biosharp | BS-15-M | |
| Clean bench | AIRTECH | BLB-1600 | |
| Constant Temperature Incubator | JINGHONG | JHS-400 | |
| Culture Dish (100 mm) | NEST | 704001 | |
| DHG Series Heating and Drying Oven | SENXIN | DGG-9140AD | |
| Electronic Analytical Balance | DENVER | TP-213 | |
| Filter Membrane (0.22 µm) | Millex GP | SLGP033NK | |
| Micro Refrigerated Centrifuge | Cence | H1650-W | |
| Microscope Slides | CITOGLAS | 01-30253-50 | |
| Milli-Q Reference | Millipore | Z00QSV0CN | |
| Normal Saline | CISEN | H37022337 | |
| Optical Microscope | Nikon | ECLIPSE E100 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Beyotime | C0221A | |
| Pipette Tip (1 mL ) | Axygene | T-1000XT-C | |
| Pipette Tip (200 µL) | Axygene | T-200XT-C | |
| Pipettor (1 mL) | Thermo Fisher Scientific | ZY18723 | |
| Pipettor (200 µL) | Thermo Fisher Scientific | ZY20280 | |
| Scalpel | MARTOR | 23111 | |
| Small-sized Vortex Oscillator | Kylin-Bell | VORTEX KB3 | |
| Tweezer | Hystic | HKQS-180 | |
| Wright Staining Solution | Beyotime | C0135-500ml |
Referencias
- Park, D. W., et al. Edoxaban versus dual antiplatelet therapy for leaflet thrombosis and cerebral thromboembolism after TAVR: The ADAPT-TAVR Randomized clinical trial. Circulation. 146 (6), 466-479 (2022).
- Devasagayam, S., Wyatt, B., Leyden, J., Kleinig, T. Cerebral venous sinus thrombosis incidence is higher than previously thought: a retrospective population-based study. Stroke. 47 (9), 2180-2182 (2016).
- Sacco, R. L., et al. An updated definition of stroke for the 21st century: a statement for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association. Stroke. 44 (7), 2064-2089 (2013).
- Thalin, C., Hisada, Y., Lundstrom, S., Mackman, N., Wallen, H. Neutrophil extracellular traps: villains and targets in arterial, venous, and cancer-associated thrombosis. Arteriosclerosis Thrombosis and Vascular Biology. 39 (9), 1724-1738 (2019).
- Mocsai, A. Diverse novel functions of neutrophils in immunity, inflammation, and beyond. Journal of Experimental Medicine. 210 (7), 1283-1299 (2013).
- Dhanesha, N., et al. PKM2 promotes neutrophil activation and cerebral thromboinflammation: therapeutic implications for ischemic stroke. Blood. 139 (8), 1234-1245 (2022).
- Ducroux, C., et al. Thrombus neutrophil extracellular traps content impair tpa-induced thrombolysis in acute ischemic stroke. Stroke. 49 (3), 754-757 (2018).
- Solomon, C., Ranucci, M., Hochleitner, G., Schochl, H., Schlimp, C. J. Assessing the methodology for calculating platelet contribution to clot strength (platelet component) in thromboelastometry and thrombelastography. Anesthesia and Analgesia. 121 (4), 868-878 (2015).
- Daraei, A., et al. Automated fiber diameter and porosity measurements of plasma clots in scanning electron microscopy images. Biomolecules. 11 (10), 1536 (2021).
- Abbasi, M., et al. Diverse thrombus composition in thrombectomy stroke patients with longer time to recanalization. Thrombosis Research. 209, 99-104 (2022).
- C W Francis, a., Marder, V. J. Concepts of clot lysis. Annual Review of Medicine. 37 (1), 187-204 (1986).
- Xu, R., Ma, G., Chen, L., Cui, X. . Preparation and application of natural fibrinolytic enzyme from peanut worm. , (2019).
- Fotso Fotso, A., Drancourt, M. Laboratory Diagnosis of tick-borne african relapsing fevers: latest developments. Front Public Health. 3, 254 (2015).
- Liou, G. Y., Byrd, C. J. Diagnostic bioliquid markers for pancreatic cancer: What we have vs. what we need. Cancers (Basel). 15 (9), 2446 (2023).
- Tang, M., Lin, H., Hu, C., Yan, H. Affinity purification of a fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus. Journal of Visualized Experiments. 196, e65631 (2023).
- Ge, Y. H., et al. A Novel antithrombotic protease from marine worm Sipunculus Nudus. International Journal Of Molecular Sciences. 19 (10), 3023 (2018).
- Talukder, M. A., Menyuk, C. R., Kostov, Y. Distinguishing between whole cells and cell debris using surface plasmon coupled emission. Biomedical Optics Express. 9 (4), 1977-1991 (2018).
- Shapiro, D. J., Hicks, L. A., Pavia, A. T., Hersh, A. L. Antibiotic prescribing for adults in ambulatory care in the USA, 2007-09. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 69 (1), 234-240 (2014).
