Verwendung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven zur Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks
Summary
Hier stellen wir ein detailliertes Protokoll zur Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke in neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen vor. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.
Abstract
Das Mikrotubuli-Netzwerk ist ein wesentlicher Bestandteil des Nervensystems. Mutationen in vielen Mikrotubuli-regulatorischen Proteinen werden mit neurologischen Entwicklungsstörungen und neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie z. B. das Mikrotubuli-assoziierte Protein Tau zu neurodegenerativen Erkrankungen, Mikrotubuli-durchtrennende Proteine Spastin und Katanin 60 verursachen erbliche spastische Querschnittslähmung bzw. neurologische Entwicklungsstörungen. Der Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken in Neuronen ist vorteilhaft für die Aufklärung der Pathogenese neurologischer Erkrankungen. Die geringe Größe der Neuronen und die dichte Anordnung der axonalen Mikrotubuli-Bündel machen die Visualisierung der Mikrotubuli-Netzwerke jedoch schwierig. In dieser Arbeit beschreiben wir eine Methode zur Dissektion der neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen der Larve sowie zur Immunfärbung von α-Tubulin und dem Mikrotubuli-assoziierten Protein Futsch zur Visualisierung von Mikrotubuli-Netzwerken in Drosophila melanogaster. Die neuromuskuläre Verbindung ermöglicht es uns, sowohl prä- als auch postsynaptische Mikrotubuli zu beobachten, und die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Durch die Mutation und Überexpression von Katanin 60 in Drosophila melanogaster und die anschließende Untersuchung der Mikrotubuli-Netzwerke in der neuromuskulären Verbindung und den Muskelzellen zeigen wir die regulatorische Rolle von Katanin 60 in der Neuroentwicklung genau auf. In Kombination mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen von Drosophila melanogaster erleichtert dieses Protokoll daher das genetische Screening und die Analyse der Mikrotubuli-Dynamik für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem erheblich.
Introduction
Mikrotubuli (MTs) spielen als einer der strukturellen Bestandteile des Zytoskeletts eine wichtige Rolle bei verschiedenen biologischen Prozessen, darunter Zellteilung, Zellwachstum und -motilität, intrazellulärer Transport und die Aufrechterhaltung der Zellform. Die Dynamik und Funktion der Mikrotubuli wird durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen wie MAP1, MAP2, Tau, Katanin und Kinesin 1,2,3,4,5 moduliert.
In Neuronen sind Mikrotubuli essentiell für die Entwicklung und Aufrechterhaltung von Axonen und Dendriten. Anomalien in den Mikrotubuli führen zu Funktionsstörungen und sogar zum Absterben von Neuronen. Im Gehirn von Alzheimer-Patienten verringert beispielsweise die Hyperphosphorylierung des Tau-Proteins die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks, was zu neurologischen Unregelmäßigkeiten führt6. Die Untersuchung von Mikrotubuli-Netzwerken wird somit zum Verständnis der neuronalen Entwicklung und der Pathogenese neurologischer Erkrankungen beitragen.
Die neuromuskuläre Verbindung (NMJ) ist die periphere Synapse, die zwischen einem Axonterminal des Motoneurons und einer Muskelfaser gebildet wird, was ein hervorragendes und leistungsfähiges Modellsystem für die Untersuchung der synaptischen Struktur und Funktionen darstellt7. Futsch ist ein Protein in Drosophila, das homolog zum Mikrotubuli-bindenden Protein MAP1B ist, das in Säugetieren vorkommt8. Es wird nur in Neuronen exprimiert und spielt eine Rolle bei der Entwicklung der synaptischen Knöpfe des NMJ 8,9. Im Wildtyp werden filamentöse Bündel, die entlang des Zentrums von NMJ-Prozessen verlaufen, durch Immunfärbung mit Anti-Futsch sichtbar gemacht. Wenn dieses Bündel das Ende von NMJ erreicht, hat es die Fähigkeit, entweder eine Schleife aus Mikrotubuli zu bilden oder seine filamentöse Struktur zu verlieren, was zu einem diffusen und punktförmigen Erscheinungsbild führt10. Mikrotubuli-Schleifen sind mit pausierten Wachstumskegeln assoziiert, was darauf hindeutet, dass das Mikrotubuli-Array stabil ist11. Daher können wir indirekt die stabile Mikrotubuli-Entwicklung im NMJ durch Futsch-Färbung bestimmen. Die Größe der Muskelzellen in der Drosophila-Larve ermöglicht eine klare Visualisierung des Mikrotubuli-Netzwerks. Die Faktoren, die die Stabilität des Mikrotubuli-Netzwerks beeinflussen, können durch die Analyse der Dichte und Form der Mikrotubuli ermittelt werden. Gleichzeitig kann der Status des Mikrotubuli-Netzwerks von Muskelzellen mit dem Ergebnis der NMJ abgeglichen werden, um umfassendere Schlussfolgerungen zu erhalten.
Viele Protokolle wurden verwendet, um das Netzwerk und die Dynamik von Mikrotubuli zu untersuchen. Diese Forschungen konzentrierten sich jedoch häufig auf In-vitro-Studien 12,13,14,15,16. Alternativ wurden in einigen In-vivo-Experimenten Elektronenmikroskopie eingesetzt, um das Zytoskelett zu detektieren17. Entsprechend der spezifischen Bindung von fluoreszenzmarkierten Antikörpern oder chemischen Farbstoffen an Proteine oder DNA erlauben die hier vorgestellten Methoden den Nachweis von Mikrotubuli-Netzwerken im NMJ auf der Ebene einzelner Neuronen in vivo, wobei die Ergebnisse durch Beobachtungen in Muskelzellen bestätigt werden. Dieses Protokoll ist einfach, stabil und wiederholbar, wenn es mit den leistungsstarken genetischen Werkzeugen kombiniert wird, die in Drosophila melanogaster verfügbar sind, und ermöglicht eine Vielzahl von phänotypischen Untersuchungen und genetischen Screenings für die Rolle von Mikrotubuli-Netzwerk-regulatorischen Proteinen im Nervensystem in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird ein Protokoll für die Dissektion und Immunfärbung von neuromuskulären Verbindungen und Muskelzellen von Drosophila-Larven beschrieben. Es gibt mehrere wesentliche Punkte zu beachten. Erstens ist es entscheidend, Verletzungen der beobachteten Muskeln während des Sezierprozesses zu vermeiden. Es kann sich lohnen, das Filet vor der Entfernung der inneren Organe zu fixieren, um einen direkten Kontakt zwischen der Zange und den Muskeln zu verhindern. Um Muskelschäden oder eine Trennung von der Epidermi…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Ying Xiong für die Diskussionen und Kommentare zum Manuskript. Diese Arbeit wird durch ein Stipendium der National Science Foundation of China (NSFC) an C. M. (31500839) unterstützt.
Materials
| Alexa Fluor Plus 405 phalloidin | invitrogen | A30104 | dilute 1:200 |
| Enhanced Antifade Mounting Medium | Beyotime | P0128M | |
| FV10-ASW confocal microscope | Olympus | ||
| Goat anti-Mouse antibody, Alexa Fluor 488 conjugated | Thermo Fisher | A-11001 | dilute 1:1,000 |
| Laser confocal microscope LSM 710 | Zeiss | ||
| Micro Scissors | 66vision | 54138B | |
| Mouse anti-Futsch antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank | 22C10 | dilute 1:50 |
| Mouse anti-α-tubulin antibody | Sigma | T5168 | dilute 1:1,000 |
| Paraformaldehyde | Wako | 168-20955 | Final concentration: 4% in PB Buffer |
| Stainless Steel Minutien Pins | Entomoravia | 0.1mm Diam | |
| Stereomicroscope SMZ161 | Motic | ||
| stereoscopic fluorescence microscope BX41 | Olympus | ||
| Texas Red-conjugated goat anti-HRP | Jackson ImmunoResearch | dilute 1:100 | |
| TO-PRO(R) 3 iodide | Invitrogen | T3605 | dilute 1:1,000 |
| Transfer decoloring shaker TS-8 | Kylin-Bell lab instruments | E0018 | |
| TritonX-100 | BioFroxx | 1139 | |
| Tweezers | dumont | 500342 |
Referencias
- Halpain, S., Dehmelt, L. The MAP1 family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 7 (6), 224 (2006).
- Sánchez, C., Díaz-Nido, J., Avila, J. Phosphorylation of microtubule-associated protein 2 (MAP2) and its relevance for the regulation of the neuronal cytoskeleton function. Progress in neurobiology. 61 (2), 133-168 (2000).
- Dehmelt, L., Halpain, S. The MAP2/Tau family of microtubule-associated proteins. Genome biology. 6 (1), 204 (2005).
- Roll-Mecak, A., McNally, F. J. Microtubule-severing enzymes. Current opinion in cell biology. 22 (1), 96-103 (2010).
- Walczak, C. E., Gayek, S., Ohi, R. Microtubule-depolymerizing kinesins. Annual review of cell and developmental biology. 29, 417-441 (2013).
- Bramblett, G. T., et al. Abnormal tau phosphorylation at Ser396 in Alzheimer’s disease recapitulates development and contributes to reduced microtubule binding. Neuron. 10 (6), 1089-1099 (1993).
- Van Vactor, D., Sigrist, S. J. Presynaptic morphogenesis, active zone organization and structural plasticity in Drosophila. Current opinion in neurobiology. 43, 119-129 (2017).
- Hummel, T., Krukkert, K., Roos, J., Davis, G., Klämbt, C. Drosophila Futsch/22C10 is a MAP1B-like protein required for dendritic and axonal development. Neuron. 26 (2), 357-370 (2000).
- Roos, J., Hummel, T., Ng, N., Klämbt, C., Davis, G. W. Drosophila Futsch regulates synaptic microtubule organization and is necessary for synaptic growth. Neuron. 26 (2), 371-382 (2000).
- Packard, M., et al. The Drosophila Wnt, wingless, provides an essential signal for pre- and postsynaptic differentiation. Cell. 111 (3), 319-330 (2002).
- Dent, E. W., Callaway, J. L., Szebenyi, G., Baas, P. W., Kalil, K. Reorganization and movement of microtubules in axonal growth cones and developing interstitial branches. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (20), 8894-8908 (1999).
- Tanaka, E. M., Kirschner, M. W. Microtubule behavior in the growth cones of living neurons during axon elongation. The Journal of cell biology. 115 (2), 345-363 (1991).
- Ahmad, F. J., Yu, W., McNally, F. J., Baas, P. W. An essential role for katanin in severing microtubules in the neuron. The Journal of cell biology. 145 (2), 305-315 (1999).
- Hu, Z., et al. Fidgetin regulates cultured astrocyte migration by severing tyrosinated microtubules at the leading edge. Molecular biology of the cell. 28 (4), 545-553 (2017).
- Feizabadi, M. S., Castillon, V. J. The effect of Tau and taxol on polymerization of MCF7 microtubules in vitro. International journal of molecular sciences. 23 (2), 677 (2022).
- Velasco, C. D., et al. Microtubule depolymerization contributes to spontaneous neurotransmitter release in vitro. Communications biology. 6 (1), 488 (2023).
- Höög, J. L., et al. Electron tomography reveals a flared morphology on growing microtubule ends. Journal of cell science. 124, 693-698 (2011).
- Feng, Y., Ueda, A., Wu, C. F. A modified minimal hemolymph-like solution, HL3.1, for physiological recordings at the neuromuscular junctions of normal and mutant Drosophila larvae. Journal of neurogenetics. 18 (2), 377-402 (2004).
- Broadie, K. S., Bate, M. Development of the embryonic neuromuscular synapse of Drosophila melanogaster. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 13 (1), 144-166 (1993).
- Xiong, Y., et al. HDAC6 mutations rescue human tau-induced microtubule defects in Drosophila. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (12), 4604-4609 (2013).
- Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. . Drosophila Protocols. , (2000).
- Mao, C. X., et al. Microtubule-severing protein Katanin regulates neuromuscular junction development and dendritic elaboration in Drosophila. Development. 141 (5), 1064-1074 (2014).
- Jin, S., et al. Drosophila Tubulin-specific chaperone E functions at neuromuscular synapses and is required for microtubule network formation. Development. 136 (9), 1571-1581 (2009).
- Sarthi, J., Elefant, F. dTip60 HAT activity controls synaptic bouton expansion at the Drosophila neuromuscular junction. PloS one. 6 (10), 26202 (2011).
- Weingarten, M. D., Lockwood, A. H., Hwo, S. Y., Kirschner, M. W. A protein factor essential for microtubule assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 72 (5), 1858-1862 (1975).
- Kadavath, H., et al. Tau stabilizes microtubules by binding at the interface between tubulin heterodimers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (24), 7501-7506 (2015).
- Trotta, N., Orso, G., Rossetto, M. G., Daga, A., Broadie, K. The hereditary spastic paraplegia gene, spastin, regulates microtubule stability to modulate synaptic structure and function. Current biology: CB. 14 (13), 1135-1147 (2004).
