人体骨骼肌的纤维类型鉴定

骨骼肌是一种异质性组织，具有不同的细胞代谢和收缩特性，这取决于细胞（纤维）是慢速抽搐（I 型）还是快速抽搐（II 型）。纤维类型可以通过检查肌球蛋白重链 （MHC） 亚型来识别，这些亚型在几个方面彼此不同，包括收缩时间、缩短速度和抗疲劳性¹。主要的 MHC 亚型包括 I 型、IIa 型、IIb 型和 IIx 型，其代谢特征为氧化性（I 型和 IIa 型）或糖酵解型（IIx、IIb）¹。这些纤维类型的比例因肌肉类型和物种而异。IIb型广泛存在于啮齿动物肌肉中。人体肌肉不含任何 IIb 型纤维，主要由 MHC 亚型 I 型和 IIa 型纤维组成，少量 IIx 纤维²。蛋白质表达谱因不同的纤维类型而异，并且可以随着年龄的增长^{而改变 3、运动 4,5} 和疾病⁶。

由于检查肌肉匀浆（所有纤维类型的混合物），测量不同骨骼肌纤维类型的细胞反应经常被忽视或不可能。单纤维蛋白质印迹法可研究单个肌肉纤维中的多种蛋白质⁷.该方法以前已被用于产生新颖且信息丰富的单纤维特性，而使用匀浆制剂无法获得这些特性。然而，原始的单纤维蛋白质印迹方法存在一些局限性，包括耗时、无法生成样品重复以及使用昂贵、灵敏的增强化学发光 （ECL） 试剂。如果使用新鲜组织，由于需要在有限的时间范围内（即 1-2 小时）分离单个纤维的时间限制，这种方法会进一步受到限制。幸运的是，通过从冻干组织中分离出单纤维片段来缓解这种限制⁸。然而，从冻干样本中收集纤维受到活检组织的大小和质量的限制。

使用斑点印迹方法⁹的纤维类型鉴定已在本综合方案中得到了显着阐述和扩展。先前，已经证明，低至 ~2-10 mg 的湿重肌肉组织就足以进行冷冻干燥和单纤维 MHC 亚型蛋白分析⁹。Christensen等人⁹使用30%的~1 mm纤维片段通过斑点印迹检测MHC亚型，并通过蛋白质印迹证实了这一点。这项工作表明，通过用斑点印迹代替蛋白质印迹，总成本降低了 ~40 倍（对于 50 个纤维片段）。然后将纤维“汇集”到 I 型和 II 型样品中，从而允许实验复制⁹。然而，局限性是仅获得两种纤维类型特异性样品：I型（MHCI阳性）和II型（MHCII阳性纤维），II型样品含有MHCIIa和MHCIIx ^6,10的混合物。值得注意的是，当前的协议演示了如何识别纯IIx型光纤，并提供了非常详细的工作流程（如图1所示），包括常见协议问题的故障排除策略。