פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)
Summary
במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאפיון ביופיזיקלי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה המכוונת לכימרות (PROTACS) המערבות את ליגאזות היוביקוויטין, Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) ו-Cereblon (CRBN). שיטות ביופיזיקליות המודגמות כאן כוללות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC).
Abstract
ליגאזות E3 וחלבונים המיועדים לפירוק יכולים להיווצר קומפלקסים על ידי מולקולות הטרוביפונקציונאליות בתהליך רב-שלבי. הקינטיקה והתרמודינמיקה של האינטראקציות המעורבות תורמות ליעילות היוביקוויטינציה וכתוצאה מכך לפירוק החלבון. טכניקות ביופיזיקליות כגון תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה של שכבה ביולוגית (BLI) וקלורימטריית טיטרציה איזותרמית (ITC) מספקות מידע רב ערך שניתן להשתמש בו באופטימיזציה של אינטראקציות אלה. באמצעות שתי מערכות מודל, הוקמה ערכת כלים לבדיקה ביופיזית להבנת הקואופרטיביות של היווצרות מרוכבים טרינריים והשפעת “אפקט הוו” על קינטיקה קשירה. במקרה אחד, נבדקה מולקולת פרוטאוליזה המכוונת לכימרה (PROTAC) שגרמה להיווצרות קומפלקס טרינרי בין Brd4BD2 ו-VHL. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, MZ1, יש זיקות nM הן לחלבון Brd4BD2 (SPR K D = 1 nM, ITC K D = 4 nM) והן לקומפלקס VHL (SPR KD = 29 nM, itc k d = 66 nM). עבור מערכת זו, פותחו מבחני SPR, BLI ו- ITC חזקים ששיחזרו תוצאות שפורסמו המדגימות את הקואופרטיביות של היווצרות מורכבת טרינרית. במקרה השני, נחקרה מולקולה שגרמה לקומפלקסים טרינריים בין חלבון 46.0 kDa PPM1D וצרבלון [CRBN (319-442)]. למולקולה ההטרוביפונקציונלית, BRD-5110, יש SPR K D = 1 ננומטר עבור PPM1D אך קשירה חלשה בהרבה כנגד קומפלקס CRBN קטוע (319-442) (SPR KD = ~ 3 μM). במקרה זה, הכריכה עבור CRBN ב- SPR לא הייתה רוויה, וכתוצאה מכך נוצר “אפקט וו”. הוערכו דרישות התפוקה והמגיבים עבור SPR, BLI ו-ITC, וניתנו המלצות כלליות ליישומן בפרויקטים של PROTAC.
Introduction
polyubiquitination של חלבונים בתא הוא תהליך מווסת היטב המערב אנזימים ממשפחת Ubiquitin Ligase 1,2. האנזימים הסופיים במסלול הם ליגאזות יוביקוויטין E3 המצמידות באופן קוולנטי מולקולות יוביקוויטין לשותפיהן קושרי החלבונים3. הפוליוביקוויטינציה של אותם שותפים קושרי חלבונים מכוונת אותם לפירוק פרוטאוליטי על ידי פרוטאזום4. מערכת זו היא חלק מתהליך הומאוסטזיס חלבונים אשר מונף טיפולית כדי לגרום לפירוק של חלבונים המעורבים במחלה5. מולקולות קטנות הגורמות לאינטראקציה בין ליגאזות יוביקוויטין E3, כגון Von Hippel-Lindau E3 ligase (VHL) או cereblon (CRBN), מורכבות בדרך כלל מראש קרב קושר ליגאז E3 המחובר על ידי מקשר גמיש לראש קרב שנקשר לחלבון המיועד לפירוק. מולקולות הטרוביפונקציונאליות אלה מכונות בדרך כלל פרוטאוליזה המכוונת לכימרות או פרוטאקים6.
הפיתוח של PROTACS כרוך בהערכת היכולת של מולקולות לגרום לפירוק של חלבונים בתאים. פותחו מערכות בדיקה תאיות רבות המנטרות את האינטראקציה המושרה בין חלבון המטרה לבין רכיבי ליגאז E3, כגון VHL או CRBN, בעת הטיפול בתאים במולקולת PROTAC. ניסוי תאי אחד כזה, מערכת ננולוק-הלוטג7, כולל ליגאז E3 המאוחה למקבל ההלוטאג וחלבון מטרה המתויג עם תורם ננולוק. היווצרות מורכבת טרינרית מביאה את תורם ננולוק ומקבל הלוטג לקרבה ומאפשרת העברת אנרגיה מהתורם למקבל וכתוצאה מכך פליטת אור. ניתן להשתמש בווריאציות של מערכת זו כדי להעריך את החדירות התאית של מולקולות PROTACS8 או שינויים ברמה היחסית של יוביקוויטינציה של חלבון המטרה9. בעוד שמערכות תאיות אלה חיוניות להנעת אופטימיזציה של PROTACS, היווצרות קומפלקסים בין ליגאזות E3 וחלבונים המיועדים לפירוק היא תהליך רב-שלבי10,11. הקינטיקה והתרמודינמיקה של האינטראקציות הבינאריות והטרינריות המעורבות תורמות ליעילות יוביקוויטינציה וכתוצאה מכך לפירוק החלבון12,13,14.
להלן מתוארים פרוטוקולים שניתן להתאים לאפיון ביופיזי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTACS באמצעות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC). פרוטוקולי SPR ו-ITC עבור מולקולת MZ1 PROTAC הגורמת להיווצרות קומפלקס טרינרי בין Brd4BD2 ו-VHL שנגזרו מדוחות ספרות13,15 ומתוארים כאן הצליחו לשחזר את התוצאות המדווחות עם שינוי מסוים של ההליכים המדווחים, אשר יידונו. תיאור של בדיקת BLI המשמשת להערכת היווצרות מורכבת טרינרית בין MZI, Brd4BD2 ו- VHL נכלל בדוח זה. מדידות הזיקה מ-BLI היו עקביות עם אלה שנצפו ב-SPR וב-ITC. פרוטוקול שפורסם בעבר ובו פותחה בדיקת SPR להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTAC בין PPM1D, חלבון Ser/Thr פוספטאז שביטויו מושרה באופן תלוי p5316, לבין CRBN מתואר גם כן. במקרה זה, למולקולת PROTAC יש זיקה ננו-מולרית ל-PPM1D אך רק זיקה מיקרומולרית ל-CRBN. במקרה זה, הקישור של מולקולת PROTAC ל-CRBN אינו רווי, וכתוצאה מכך נוצר “אפקט הוו” הנפוץ. אפקט הקרס הוא תכונה של שלוש מערכות גוף שבהן ישנם שני מינים שיכולים ליצור קומפלקס הטרוטרימרי כאשר שניהם קשורים למולקולת גישור (איור 1)17. אפקט הקרס נצפה כאשר המין המגשר נמצא בריכוז עודף ביחס לשני המינים האחרים. המצב המתקבל הוא מצב שבו האינטראקציות הבינאריות עולות על האינטראקציות הטרינריות. המערכות שבהן נצפה אפקט הוו דורשות שיקולי תכנון ניסוייים ספציפיים שנדונו בדו”ח זה. מושגים כלליים ודרישות מגיב להערכת השימוש בבדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי PROTAC מסופקים.
Protocol
Representative Results
Discussion
אפיון ביופיזי של יחסי הגומלין הבינאריים והטרינריים בין מולקולות פרוטאק לבין שותפיהן הקושרים חלבונים יכול לספק תובנות ייחודיות ומשלימות ביחס למערכות תאיות בשימוש נרחב. הבנת הזיקה בין כל ראש קרב של מולקולת PROTAC לבין שותפיה קושרי החלבונים יכולה לעזור להנחות את מאמצי הכימיה הרפואית לקראת או…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס חדשנות ופיתוח טכנולוגיה מהמרכז לפיתוח טיפולים במכון ברוד של MIT והרווארד. המחברים מבקשים להודות לחברי צוות ההנהגה הבכירה ולוועדת הביקורת על תמיכתם בעבודה זו.
Materials
| 96-plate | Greiner | 655076 | flat-bottom, black plates used In BLI experiments |
| 96-well plate | Nunc | 73520-120 | Plate use for ITC sample preparation |
| 96-well plate | Greiner | 650101 | Plate used to prepare samples for SPR experiments |
| Auto iTC200 micro-calorimeter | Malvern Panalytical | Instrument used to perform ITC experiments. Product discontinued. | |
| Biacore S200 | Cytiva | 29136649 | Instrument used to perform SPR experiments |
| MZ1 | ProbeChem | PC-60099 | PROTAC that binds to VHL and Brd4BD2 |
| NTA sensor chip | Cytiva | BR100532 | SPR chip used to perform SPR experiments involving PPM1D |
| Octet Red-384 | Sartorius | Instrument used to perform BLI experiments. Product discontinued. | |
| Plate cover | Malvern | PQA0001 | Cover for Nunc 96-well plate (73520-120) |
| Plate cover | Cytiva | 28975816 | Plate cover for Greiner plate (650101) |
| Series S SA sensor chip | Cytiva | BR100531 | SPR chip used to perform SPR experiments involving MZ1:VHL:BRD4 |
| Streptavidin (SA) Dip and Read Biosensors | Sartorius | 18-509 | Coated sensors used in BLI experiments |
Referencias
- Balaji, V., Hoppe, T. Regulation of E3 ubiquitin ligases by homotypic and heterotypic assembly. F1000Research. 9, (2020).
- Song, L., Luo, Z. -. Q. Post-translational regulation of ubiquitin signaling. Journal of Cell Biology. 218 (6), 1776-1786 (2019).
- Yang, Q., Zhao, J., Chen, D., Wang, Y. E3 ubiquitin ligases: styles, structures and functions. Molecular Biomedicine. 2 (1), 23 (2021).
- Grice, G. L., Nathan, J. A. The recognition of ubiquitinated proteins by the proteasome. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 73 (18), 3497-3506 (2016).
- Chirnomas, D., Hornberger, K. R., Crews, C. M. Protein degraders enter the clinic – a new approach to cancer therapy. Nature Reviews Clinical Oncology. 20 (4), 265-278 (2023).
- Toure, M., Crews, C. M. Small-molecule PROTACS: New approaches to protein degradation. Angewandte Chemie (International ed. In English). 55 (6), 1966-1973 (2016).
- Ottis, P., Toure, M., Cromm, P. M., Ko, E., Gustafson, J. L., Crews, C. M. Assessing different E3 ligases for small molecule induced protein ubiquitination and degradation. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2570-2578 (2017).
- Riching, K. M., et al. Quantitative live-cell kinetic degradation and mechanistic profiling of PROTAC mode of action. ACS Chemical Biology. 13 (9), 2758-2770 (2018).
- Nabet, B., et al. The dTAG system for immediate and target-specific protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (5), 431-441 (2018).
- Paiva, S. -. L., Crews, C. M. Targeted protein degradation: elements of PROTAC design. Current Opinion in Chemical Biology. 50, 111-119 (2019).
- Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual Review of Biochemistry. 67, 425-479 (1998).
- Chan, K. -. H., Zengerle, M., Testa, A., Ciulli, A. Impact of target warhead and linkage vector on inducing protein degradation: Comparison of bromodomain and extra-terminal (BET) degraders derived from triazolodiazepine (JQ1) and tetrahydroquinoline (I-BET726) BET inhibitor scaffolds. Journal of Medicinal Chemistry. 61 (2), 504-513 (2018).
- Roy, M. J., et al. SPR-measured dissociation kinetics of PROTAC ternary complexes influence target degradation rate. ACS Chemical Biology. 14 (3), 361-368 (2019).
- Pierce, N. W., Kleiger, G., Shan, S., Deshaies, R. J. Detection of sequential polyubiquitylation on a millisecond timescale. Nature. 462 (7273), 615-619 (2009).
- Gadd, M. S., et al. Structural basis of PROTAC cooperative recognition for selective protein degradation. Nature Chemical Biology. 13 (5), 514-521 (2017).
- Nahta, R., Castellino, R. C. Phosphatase magnesium-dependent 1 δ (PPM1D), serine/threonine protein phosphatase and novel pharmacological target in cancer. Biochemical Pharmacology. 184, 114362 (2021).
- Douglass, E. F., Miller, C. J., Sparer, G., Shapiro, H., Spiegel, D. A. A comprehensive mathematical model for three-body binding equilibria. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 6092-6099 (2013).
- Zorba, A., et al. Delineating the role of cooperativity in the design of potent PROTACs for BTK. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (31), E7285-E7292 (2018).
- Fairhead, M., Howarth, M. Site-specific biotinylation of purified proteins using BirA. Methods in Molecular Biology. 1266, 171-184 (2015).
- Nowak, R. P., et al. Plasticity in binding confers selectivity in ligand-induced protein degradation. Nature Chemical Biology. 14 (7), 706-714 (2018).
