Drosophila, miyogenezi düzenleyen anahtar molekülleri incelemek için iyi kurulmuş bir modeldir. Bununla birlikte, mevcut yöntemler, mRNA transkripsiyonel dinamiklerini ve sinsitya içindeki uzamsal dağılımı belirlemek için yetersizdir. Bu sınırlamayı ele almak için, mRNA’ların tek molekül ölçeğinde saptanmasına ve miktarının belirlenmesine izin veren bir RNA floresan in situ hibridizasyon yöntemini optimize ettik.
İskelet kasları, kuvvet üreten ve vücut hareketini sağlayan birçok demetlenmiş miyofiberden oluşan büyük sinsitialardır. Drosophila , kas biyolojisini incelemek için klasik bir modeldir. Hem Drosophila genetiğinin hem de gelişmiş omik yaklaşımların kombinasyonu, kas morfogenezini ve rejenerasyonunu düzenleyen anahtar korunmuş moleküllerin tanımlanmasına yol açtı. Bununla birlikte, bu moleküllerin transkripsiyonel dinamikleri ve haberci RNA’larının sinsitya içindeki uzamsal dağılımı geleneksel yöntemlerle değerlendirilemez. Burada, yetişkin uçuş kasları ve kas kök hücreleri içindeki bireysel mRNA moleküllerinin saptanmasını ve ölçülmesini sağlamak için mevcut bir tek moleküllü RNA floresan in situ hibridizasyon (smFISH) yöntemini optimize ettik. Kavramın bir kanıtı olarak, iki evrimsel korunmuş transkripsiyon faktörünün, Mef2 ve Zfh1/Zeb’nin mRNA ekspresyonunu ve dağılımını analiz ettik. Bu yöntemin, kas öncü hücrelerindeki, yetişkin kaslarındaki ve kas kök hücrelerindeki her iki transkript için tek mRNA moleküllerini verimli bir şekilde tespit edebildiğini ve ölçebildiğini gösteriyoruz.
Yetişkin iskelet kasları, kasılma özellikleri hareketler üreten farklılaşmış çok çekirdekli miyoliflerden yapılır. Kas büyümesi, bakımı ve rejenerasyonu, embriyonik gelişim sırasında belirtilen kas progenitörlerine ve kas kök hücrelerine (MuSC’ler) dayanır1. Miyojenik program, bir dizi çekirdek miyojenik transkripsiyon faktörü (TF’ler) tarafından hassas bir şekilde kontrol edilir (örneğin, Pax3 / 7, MYOD, Mef2 ve ZEB)2,3,4. Kas biyolojisini düzenleyen moleküler mekanizmaların deşifre edilmesi, miyoloji ile ilgili temel soruların aydınlatılması ve kas dejeneratif hastalıkların tedavisinde olası terapötik kullanım için önemlidir.
Drosophila, miyogenez5’i incelemek için genetik bir model olarak uzun bir geçmişe sahiptir. Son zamanlarda kas rejenerasyonunu araştırmak için yeni bir model olarak ortaya çıkmıştır 6,7,8. Kas yapısı ve çekirdek miyojenik programlar, sinekler ve memeliler arasında yüksek oranda korunur. Örneğin, TF’ler Mef2 ve Zfh1 / ZEB, kas gelişimini ve rejenerasyonunu düzenlemede korunmuş bir işleve sahiptir 3,9,10,11. Dolaylı Uçuş Kasları (IFM’ler) gibi yetişkin Drosophila kasları, Yetişkin Kas Progenitörleri (AMP’ler) olarak bilinen belirli bir MuSC popülasyonundan oluşur12. Bu AMP’ler embriyogenez sırasında belirlenir ve kanat ve bacak diskleri gibi epitel yapılarıyla ilişkilidir. Embriyonik ve larva aşamaları boyunca, AMP’ler, IFM’leri oluşturmak için farklılaşma ve füzyona girdiklerinde metamorfoza kadar farklılaşmadan kalırlar13,14. TF Spalt majör (spalt, salm) uçuş kas gelişimi sırasında eksprese edilir ve yapısal kimliklerini belirlemek için gereklidir15. Mef2, yetişkin kas oluşumu için gerekli olan bir diğer önemli miyojenik TF’dir 16,17. AMP’lerde ifade edilir ve yetişkin IFM’lerde10,18 korunur. AMP’lerin çoğunluğu fonksiyonel kaslara farklılaşırken, bir alt küme farklılaşmadan kaçar ve yetişkin MuSC’lerioluşturur 11. Omurgalılara benzer şekilde, yetişkin MuSC’lerin erken farklılaşmasını önlemek ve gövdelerini korumak için TF Zfh1/ZEB gereklidir 9,10.
Gen ekspresyon dinamiklerinin çeşitli kas biyolojik süreçlerini düzenlediği kanıtlanmıştır 19,20. Yüksek verimli tek hücreli ve tek çekirdekli RNA dizileme tekniklerinin ortaya çıkışı, bu transkripsiyonel dinamiklerin kapsamlı bir şekilde araştırılmasını sağlamıştır21,22. Bu yaklaşımların dikkate değer bir sınırlaması, çok çekirdekli kas liflerinde mRNA moleküllerinin uzamsal dağılımını sağlayamamalarıdır. Bu özellikler, iki tip mRNA gövdesini ortaya çıkaran tek moleküllü floresan in situ hibridizasyon (smFISH) ile araştırılabilir: 1. Sitoplazmada yayılmış ve olgun RNA’yı temsil eden bireysel mRNA molekülleri ve 2. En fazla iki parlak nükleer odak, yeni ortaya çıkan transkripte karşılık gelir ve transkripsiyonel olarak aktif alelleriortaya çıkarır 23. Bu nedenle, smFISH, bireysel mRNA molekülü miktar tayini için tercih edilen bir yöntemdir, uzamsal dağılımlarını araştırır ve gen transkripsiyonel dinamiklerinin anlık görüntülerini sağlar.
smFISH yöntemi, hedef transkripti tamamlayıcı olacak şekilde özel olarak tasarlanmış bir dizi kısa floresan oligonükleotid probuna dayanır. Tavlama üzerine, konfokal mikroskopi24 kullanılarak mRNA’nın tek molekül seviyesinde saptanmasına izin veren yüksek yoğunluklu nokta kaynakları üretir. Bu yöntem, memeli kas dokuları da dahil olmak üzere çok çeşitli hücre tipleri için giderek daha fazla uygulanmaktadır19,20. Bununla birlikte, diğer hayvan modellerinde olduğu gibi Drosophila’da, yetişkin kas gen ekspresyonu hakkındaki bilgilerin çoğu, mRNA moleküllerinin uzamsal konumu hakkında nicel bilgiden yoksun olan toplu moleküler deneylerden türetilmiştir. Burada, kas öncü hücreleri ve yetişkin Drosophila kasları 23,25 üzerinde smFISH gerçekleştirmek için bir yöntemi optimize ettik. Bu protokol, çekirdek segmentasyonu ve mRNA sayımı ve lokalizasyonu için tam otomatik bir analiz hattı içerir.
smFISH yönteminin uygulanması, çeşitli hücre tiplerine ve model organizmalara kadar uzanan kullanımı ile son zamanlarda popülerlik kazanmıştır. Bununla birlikte, Drosophila durumunda, yetişkin kas gen ekspresyonu hakkındaki bilgilerin çoğu, mRNA moleküllerinin kesin uzamsal konumu hakkında nicel bilgi sağlayamayan toplu moleküler deneylerden türetilir. Bu boşluğu gidermek için, kas öncü hücreleri ve yetişkin Drosophila kasları üzerinde smFISH gerçekleştirmek için bir yöntemi optimize ettik. Bu yaklaşım daha önce yayınlanmış bir protokol23’ten uyarlanmış ve Drosophila kas dokuları için optimize edilmiştir.
Yüksek kaliteli smFISH görüntüleri elde etmenin önündeki en büyük engel, probların optimum penetrasyonunu engelleyen yetişkin kaslarının kalınlığıdır. Bu nedenle, yetişkin kaslarını hayvanın diğer dokularından ayırmak ve hibridizasyon işlemini hafif ajitasyon ile gerçekleştirmek çok önemlidir. Bu özel adım, dokuların etkili bir şekilde geçirgenleşmesini sağlar.
Bir diğer kritik husus, sinyal-gürültü oranının, hesaplama boru hattının belirli mRNA noktalarını tespit etmede başarısız olmasına neden olabilmesidir. Sinyal-gürültü oranının arttırılmasının, probların optimal konsantrasyonunu bularak elde edilebileceğini bulduk. Optimum seyreltme, konjuge boya ve oligonükleotid bileşimi dahil olmak üzere her bir prob setinin bileşimine bağlı olarak farklılık gösterebilir. Farklı seyreltmeler denemenizi öneririz; 200 nM’lik son bir seyreltme, bu deneylerde yetişkin dokular için en iyi sinyal-gürültü oranını verdi.
smFISH yöntemi ile TS odaklarında yeni sentezlenen RNA’ların sayısını ölçmek mümkündür. Bir gen aktif olarak kopyalandığında, TS’de aynı anda birden fazla yeni RNA üretilir. Sonuç olarak, TS’nin yoğunluğu olgun sitoplazmik RNA’nınkini aşacaktır ve bu özellik, nükleer lokalizasyonu ile birleştiğinde, TS’yi bireysel sitoplazmik RNA’lardan ayırt edebilir. Kas biyolojisi bağlamında, TS tespiti ve miktar tayini, aynı sinsityum içindeki kas çekirdekleri arasında belirli bir genin transkripsiyonunun senkronizasyonunu belirlemek için özellikle önemlidir. Bununla birlikte, bu hesaplama boru hattı, sitoplazmik mRNA ve TS sinyalleri arasında ayrım yapmak için tasarlanmamıştır. Alternatif olarak, bu smFISH yöntemini BayFISH veya FISH-quant29,30 gibi diğer köklü smFISH analiz araçlarıyla birleştirmenizi öneririz. Bu araçların, RNA agregalarının otomatik segmentasyon ve floresan yoğunluğu hesaplamalarını dikkate değer bir hassasiyetle kolaylaştırdığı kanıtlanmıştır.
Son olarak, smFISH, yüksek uzamsal çözünürlüğe sahip mRNA moleküllerini tespit ederken, aynı anda az sayıda mRNA’yı analiz etmekle sınırlıdır. merFISH (çoklanmış hata-sağlam floresan in situ hibridizasyon) gibi çok ölçekli yöntemler, çok sayıda farklı mRNA31’in aynı anda analiz edilmesini sağlar. Oligonükleotid probları ve hata düzeltme kodlarını birleştiren bu yöntem, tek hücrelerde yüzlerce RNA türünün tespitini kolaylaştırır.
The authors have nothing to disclose.
Alain Vincent’a el yazmasını eleştirel okuması için teşekkür ederiz. Zfh1 antikorunu sağladığı için Ruth Lehmann’a teşekkür ederiz. MRic Görüntüleme Platformu’nda konfokal mikroskopi için Stephanie Dutertre ve Xavier Pinson’ın yardımlarını kabul ediyoruz. EL, ministère de l’enseignement supérieur et de la recherche scientifique’den doktora bursu ile desteklenmektedir. NA, AFM-Telethon Ph.D. burs 23846. TP, Chan Zuckerberg Girişimi DAF’ın T.P.’ye (2019-198009) verdiği hibe ile finanse edilmektedir. HB, CNRS, Atip Avenir programı ve AFM-Telethon trambolin hibesi 23108 tarafından desteklenmektedir.
Confocal microscope SP8 | Leica | SP8 DMI 6000 | |
DAPI | ThermoFisher | 62248 | |
Double-sided tape | Tesa | 57910-00000 | |
Dumont #55 Forceps | Fine Science Tools | 11255-20 | |
Formaldehyde 16% | Euromedex | EM-15710 | |
Mef2 antibody | DHSB | NA | |
PBS 10x | Euromedex | ET330 | |
RNaseZAP | Sigma-Aldrich | R2020 | |
Stellaris probes | LGC | NA | |
Stellaris RNA FISH Hybridization Buffer | LGC | SMF-HB1-10 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer A | LGC | SMF-WA1-60 | |
Stellaris RNA FISH Wash Buffer B | LGC | SMF-WB1-20 | |
Swann-Morton Blades | Fisher scientific | 0210 | |
ThermoMixer | Eppendorf | 5382000015 | |
Triton X-100 | Euromedex | 2000 | |
UAS-mCD8::GFP line | Bloomington | RRID:BDSC_5137 | |
Ultrapure water | Sigma-Aldrich | 95284 | |
Watch Glass, Square, 1 5/8 in | Carolina | 742300 | |
Zfh1 antibody | Gifted by Ruth Leahman | ||
Zfh1-Gal4 | Bloomington | BDSC: 49924, FLYB: FBtp0059625 |