Memeli Hücrelerinin İn Situ Kriyotomografisi için Numune Hazırlama

1. Izgara hazırlığı NOT: Deneysel tasarımda, daldırma-dondurma seansı başına toplam maksimum 8-12 ızgara ve kuyu başına 4-5 ızgara planlayın. Bundan daha fazlası, hücre stresinin artmasına, buz kontaminasyonuna ve kullanıcı hatalarına neden olabilecek çok uzun bir dalma-dondurma seansına yol açacaktır. Kızdırma deşarjıBir kızdırma deşarj cihazında 0,39 mBar atmosferde 45 saniye boyunca 15 mA’da kızdırma deşarjı yapılacak delikli bir karbon destek filmi ile uygun sayıda ızgara yükleyin. Izgaranın karbon tarafının yukarı baktığından emin olun. Bitirdiğinizde, ızgaraları filtre kağıdıyla kaplı temiz bir kaba aktarın (Şekil 1A 1).NOT: Malzeme hücreler için toksik olmadığı sürece (herhangi bir bakır ızgara hariç) diğer ızgaralar kullanılabilir. Bulucu ızgaraları, bağıntılı etütler için kullanışlıdır. Diğer malzemelerden yapılmış ızgaralar da mümkündür. Birçok laboratuvar, SiO2 destek ızgaraları 8,9’un üzerinde hücre yetiştirme konusunda iyi sonuçlar elde etti. Yapışkan tedaviIzgaraları, fibronektini, PBS’yi, plakaları ve cımbızı bir biyogüvenlik kabinine aktarın. Izgaraların her iki tarafını 20 μg / mL sığır fibronektini ile 6 oyuklu bir plakanın kapağı gibi steril bir yüzeye iki cömertçe boyutlandırılmış yapışkan çözelti noktasını mikropipetleyerek tedavi edin. Noktaların tüm ızgarayı saracak kadar büyük olduğundan emin olun (yaklaşık 100 μL önerilir).NOT: Seçilen yapışkan çözelti ile işlemden önce, ızgara karelerinin ortasındaki hücrelerin bağlanmasını optimize etmek için burada ızgarayı foto-mikro modelleme seçeneği vardır. Hücrelerin çubuklara bağlanma yeteneğinin azaltılması, görüntülenebilir hücrelerin sayısını artıracaktır. Bu, kriyoFIB öğütmeyi içeren deneyler için idealdir. Izgaraları değiştirmek için 5/15 cımbız kullanın. Izgaranın her iki tarafını da çözelti içinde tedavi ettiğinizden emin olun.NOT: Diğer yapışkan solüsyonlar kullanılabilir (fibrinojen, kollajen, diğer hücre dışı matris bileşenleri, vb.). Fibronektin, çok çeşitli hücre dizileri ile iyi sonuçlar verdiği için burada kullanılır. (U2OS, HeLa, Vero, Calu-3, Tzm-bl). 5/15 cımbız, geometrisi 6 oyuklu plakalar, 35 mm’lik tabaklar ve mikro kızaklar etrafında gelişmiş manevra kabiliyeti sağladığı için kullanışlıdır. Bu, ızgaralar üzerinde daha az mekanik stres ve daha sağlam bir karbon filmi ile sonuçlanır. Başlamadan önce gerekli tüm malzemelerin biyogüvenlik kabinine yerleştirildiğinden emin olun, çünkü bu, şebeke kontaminasyonu olasılığını azaltır. Izgaraların takılmasıSığır fibronektini ile tedavi edildikten sonra, ızgara yapışkan hale gelecektir. 5/15 cımbız kullanarak, ızgaranın karbon olmayan yüzeyine boş bir tabağın/tabağın dibine hafifçe dokunun ve cımbızı açın. Izgara yeni yüzeye kolayca yapışmalıdır (Şekil 1A2).NOT: Izgaraları tabağın/tabağın doğrudan ortasına veya kenarlarına yerleştirmekten kaçının. Hücre eklerken, hücre yoğunluğunun plakanın merkezinde birikme eğilimi vardır. Bu, aşırı hücresel yoğunluğa sahip ızgaralara neden olabilir. Alternatif olarak, hücreleri doğrudan tabağın/tabağın12 yüzeyine tutturmak yerine burada 3D baskılı ızgara tutucular kullanılabilir. KuluçkaIzgaraları fibronektin yapışkan çözeltisinde (20 μg / mL) 30 dakika inkübe edin. Bu işlem sırasında ızgaraların kurumamasını sağlamak için, her 15 dakikada bir doğrudan ızgaraların üzerine 1-2 damla daha yapışkan çözelti damlatın (Şekil 1A3).NOT: Kuluçka süresi, kullanılan yapışkan çözeltiye bağlı olarak değişecektir. Sığır fibronektini için önerilen süre 30 dakikadır. Yıkamaİnkübasyon süresinin ardından, fazla yapışan çözeltiyi mikropipetleme yoluyla çıkarın. Izgaraları, PBS damlalarını doğrudan ızgaraların üzerine mikropipetleyerek yıkayın. Bunu 2-3 kez tekrarlayın. (Şekil 1A4). SterilizasyonBiyogüvenlik kabinindeki ızgaraları 1 saat sterilize etmek için UV ışığı kullanın. Sterilizasyonu en üst düzeye çıkarmak için ızgaraları UV kaynağına mümkün olduğunca yakın yerleştirin (Şekil 1A5). Bu işlem sırasında ızgaraların kurumamasını sağlamak için, her 10 dakikada bir doğrudan ızgaraların üzerine 1-2 damla PBS mikropipetleyin.NOT : 1.4-1.6 adımları aynı anda gerçekleştirilebilir. 2. Tohumlama ızgaraları Hücre sayısı:Mekanik veya enzimatik yöntemler kullanarak hücreleri ayırın ve sayın. Saymadan önce tohumlama için kullanılacak optimum hücre sayısını belirleyin. 6 oyuklu bir plakaya ekilen U2OS için, oyuk başına 6 x 104 ila 1,6 x 105 hücre arasında herhangi bir yerde kullanın (Şekil 1B1).NOT: Ekilen hücre sayısı, hücre tipine, kuyunun yüzey alanına, kullanılan çanak veya mikro slayta, tohumlama ve daldırma dondurma arasındaki süreye ve deney tasarımına göre değişecektir. Daldırma donması sırasında ızgara karesi başına 0,25-1 hücre ile sonuçlanacak koşulları belirlemek için bir dizi hücre sayısını test edin. Yüksek hücre yoğunluğunun ısı transfer hızını azalttığını ve vitrifikasyon sürecini etkileyebileceğini unutmamak önemlidir. Bununla mücadele etmek için, bazı laboratuvarlar, hücre kümelerinin oluşmasını önlemek için hareket eden hücre süzgeçlerini kullanarak başarı elde ettiler13. Son olarak, bu protokol, hücrelerin karbon tabakasına rastgele bağlanmasıyla sonuçlanır. Hedefli bir bağlantı gerekliyse, foto-mikro modelleme kullanılabilir (bkz. adım 1.3)14. Hücrelerin ve büyüme ortamının eklenmesi : Kabarcıklardan kaçınarak hücreleri mikropipet aracılığıyla kuyucuklara ekleyin (Şekil 1B2). 6 oyuklu bir plakada, toplam 1.5-2.0 mL’lik bir kuyu hacmi önerilir.NOT: Tüm hacmi eklemeden önce ızgaraların etrafını dikkatlice ıslatmanız önerilir. Bu, ızgaraların çözümde ayrılmasını ve yüzmesini önlemeye yardımcı olur. Kuyucuk üzerinde homojen hücre dağılımını kolaylaştırmak için plakayı yavaşça yan yana hareket ettirin. Plakayı dairesel hareketlerle döndürmeyin, çünkü bu, kuyu merkezinde aşırı hücre yoğunluğunun tahsis edilmesine neden olur. İnkübasyon: Slaytları, sonraki uygulamalara bağlı olacak deney tasarımına göre uygun bir süre için 37 °C’de inkübe edin. Bu örnek için (HIV moleküler klonlarının transfeksiyonu), 16-24 saat arasında inkübe edin (Şekil 1B3).NOT: Daha uzun inkübasyon süreleri, daha fazla hücre bölünmesi döngüsüne neden olacaktır. Bu nedenle, tohumlama için başlangıç hücre sayısını buna göre ayarlayın. 3. Transfeksiyon Transfeksiyon karışımının hazırlanması:Seçilen hücre hattına plazmit transfeksiyonu için uygun bir katyonik lipozom reaktifi hazırlayın. Bu transfeksiyon örneğinde, HIViΔEnv plazmidinin psPAX2 plazmidine 1:3 oranında transfekte edilecek oyuk başına (6 oyuklu bir plakada) 1 μg toplam plazmit DNA kullanın. Her kuyucuk için 1 μg DNA’yı 50 μL serumsuz DMEM’e seyreltin. Karışımı tekrar tekrar mikropipetleyerek veya plakayı hafifçe döndürerek homojenize edin. Her kuyucuk için, 3 μL transfeksiyon reaktifini serumsuz DMEM’de seyreltin, ardından karışımı mikropipetleme veya hafifçe döndürme ile tekrar homojenize edin. Seyreltilmiş transfeksiyon reaktif karışımının tamamını seyreltilmiş DNA karışımına ekleyin (adım 3.1.2) ve oda sıcaklığında (RT) 15 dakika inkübe edin (Şekil 1C1).NOT: Bu karışım inkübe edilirken, kuyucuklardaki ortamı 1.5 mL taze DMEM ile değiştirin. Izgaraları kuyu dibinden çıkarmamaya dikkat edin. Transfeksiyon karışımını uygulamak için, her bir oyuğa adım 3.1.3’ten itibaren karışımın 100 μL’sini damla damla pipetleyin ve teması sağlamak için damlaları ızgaralar üzerinde yoğunlaştırın (Şekil 1C2). Transfeksiyondan 16-24 saat sonra büyüme ortamını değiştirin (Şekil 1C3). 4. Daldırmalı dondurma NOT: Lekeleme için gerekli olana kadar hücreleri 37 °C’de tutun. Ek olarak, işlem boyunca ızgaraların karbon tarafını not ettiğinizden emin olun. Hücre yoğunluğuIzgaraları ters çevrilmiş bir optik mikroskopta kontrol edin ve her ızgaradaki hücre yoğunluklarını not edin.NOT: Izgara karesi başına 0,25’ten az hücre (veya her 4 ızgara karesinde bir hücre) bulunan ızgaralar ‘boş’ olarak kabul edilir. Izgara karesi başına 0,25-1 hücreli ızgaralar ‘normal’ olarak kabul edilir. Izgara karesi başına 1’den fazla hücre içeren ızgaralar ‘dolu’ olarak kabul edilir. Daldırma-dondurma sırasında daha sonra lekeleme sürelerinin çevrilmesine izin vermek için her ızgaradaki hücre yoğunluğunu not edin. Boş bir tabağa/tabağa 2-3 mL PBS ekleyin ve 37 °C’ye ısıtın. Mütevelli heyetlerinin hazırlanmasıAşağı akış kriyotomografi uygulamaları için altın referans hazırlamak için, 50 μL 10 nm kolloidal altın boncuk çözeltisini temiz bir 1,5 mL’lik tüpe pipetleyin. Tüpe 2 μL 1 mg/mL BSA ekleyin ve tekrar tekrar mikropipetleme yaparak homojenize edin. Tüpü 15.000-20.000 x g’da 15 dakika santrifüjleyin. Peletleri bozmadan süpernatanı mümkün olduğunca uzaklaştırmak için mikropipet.NOT: Pelet çok gevşek olacaktır. Pelete 50 μL PBS ekleyin ve yeniden süspanse edin. Tüpü tekrar 15.000-20.000 x g’da 15 dakika santrifüjleyin. 10 μL’lik bir uç kullanarak, peletin 4 μL’sini doğrudan aspire edin ve temiz bir 1.5 mL tüpe aktarın (Şekil 1D1). Izgara başına 1 μL yıkanmış ve konsantre altın kullanın.NOT: Kullanılan referansların türü, sonraki uygulamalara bağlıdır. TEM tomografi için 10 nm altın boncuklar kullanınız. Yumuşak X-ışını tomografisi için 200 nm altın boncuklar kullanın. Korelasyon mikroskobu için floresan lateks boncuklar kullanın. Öğütme işlemi onları yok edeceğinden, kriyoFIB öğütmeyi içeren deneyler için normalde referanslar gerekli değildir. BlotÇevre odasını neme ve 30°C’ye ayarlayın (Şekil 1D1). 5/15 cımbız kullanarak bir ızgara seçin. Izgaraları PBS ile yıkayın ve dalma cımbızına aktarın (Şekil 1D2). Sabitledikten sonra 5/15 cımbızı çıkarın ve cl’yi kaydırın.amp dalma cımbız üzerinde. Izgarayı cl’ye yerleştirin ve cl’yi tutun.amp güvenli (Şekil 1D3). Izgaranın arka tarafına 1 μL altın referans ekleyin (Şekil 1D4). Izgaranın karbon tarafına 2-3 μL PBS ekleyin. Izgaranın arka tarafını lekelemek için otomatik lekeleme kullanın ve donmayı sıvı etan içine daldırın (Şekil 1D5).NOT: Optimum lekeleme için ızgara başına 3-4 μL arasında hacim olması önerilir. Izgaralar, yıkandıktan sonra değişken miktarda PBS tutabilir. Şebekede önceden var olan sıvı tutulmasını hesaba katmak için eklenen PBS hacmini ayarlayın. Altın referansların ızgaranın arkasına eklenmesi tavsiye edilir. Öne ekleme, yerleştirme noktasının yakınında altın referans havuzlarına neden olabilirken, arkadan ekleme daha homojen bir çözelti ile sonuçlanır. Lekelenme süresi, ızgaranın hücre diş hekimliğine bağlıdır. Sırasıyla boş ızgaralar için 2 s, normal için 3 s ve dolu ızgaralar için 4 s. Mevcut dalma dondurucu tipi, lekelemeye nasıl yaklaşılacağını belirleyebilir: Leica GP2 dalma dondurucu, bu protokolde kullanılan dondurucudur ve varsayılan olarak otomatik tek taraflı lekeleme yeteneğine sahiptir. Thermo Fisher Vitrobot, otomatik çift taraflı lekeleme yapar, ancak bu genellikle karbon tarafına bağlı hücrelere zarar verir. Vitrobot’ta manuel lekelemenin yanı sıra manuel yerçekimi pistonları da mümkündür.