Isolierung von gezielten hypothalamischen Neuronen zur Untersuchung der hormonellen, metabolischen und elektrischen Regulation

ANMERKUNG: Eine allgemeine Ansicht des Versuchsverfahrens ist in Abbildung 1A grafisch dargestellt. Alle Experimente mit Mäusen, die in dieser Studie durchgeführt wurden, wurden vom Animal Care and Use Committee (IACUC) unserer Institution genehmigt. Wir verwendeten 3 Monate alte C57BL6/J-Mäuse, die in einem von der Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care International (AAALAC) zugelassenen Vivarium unter der Obhut eines Tierarztes untergebracht waren. Die Mäuse lebten in großen Käfigen mit einem 12-stündigen Hell-Dunkel-Zyklus und wurden ad libitum gefüttert. 1. Bestätigung der Empfängnis und Schwangerschaft Platzieren Sie Mäuse mit beliebigem Hintergrund und Genotyp für die Zucht. Notieren Sie das Datum und das Gewicht des Weibchens vor der Empfängnis. Nach 6 Stunden wird das Weibchen mit einer Sonde auf eine Plaque untersucht. Wenn die Plaque vorhanden ist, trennen Sie das Weibchen vom Männchen. Wenn die Plaque nicht vorhanden ist, halten Sie das Weibchen bis zum nächsten Tag im Käfig und trennen Sie dann die Mäuse. An den Tagen 7, 10 und 14 nach der Empfängnis wird das Weibchen gewogen, um die Schwangerschaft zu bestätigen. 2. Medien, 24-Well-Platte und Materialvorbereitung Am Tag der Zellisolierung werden gebrauchsfertige, mit Poly-D-Lysin beschichtete Glasdeckgläser (siehe Materialtabelle) wie folgt in eine 24-Well-Platte gelegt:Sterilisieren Sie unter einer biologischen Haube eine einzelne Packung mit 15 Deckgläsern mit 70 % Ethanol und lassen Sie sie trocknen. Öffnen Sie die Packung und legen Sie die Deckgläser in eine 60-mm-Platte. Schütteln Sie die Platte horizontal, um die Deckgläser zu trennen. Drehen Sie dann die Platte um, um einzelne Deckgläser aufzunehmen, die in die Vertiefungen einer 24-Well-Platte gelegt werden sollen. Waschen Sie die Deckgläser einmal 5 Minuten lang mit 1,0 ml steriler Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS). Bereiten Sie in der Zwischenzeit 20,0 ml Beschichtungsmedium wie folgt vor: Zu 18,31 ml BME (Basal Medium Eagle + Earle’s Salts), ergänzt mit 1,0 ml hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum (FBS), fügen Sie 200 μl Natriumpyruvat (aus einem 100-fachen Stamm), 200 μl Glutamin (aus einem 200-nM-Stamm) und 100 μl Penicillin/Streptomycin (aus einem 200-fachen Stamm) hinzu. Ersetzen Sie das HBSS in den Vertiefungen durch 1,0 ml Beschichtungsmedium und legen Sie die Platte bei 37 °C in den Inkubator. Mit einem Bunsenbrenner drei Pasteurpipetten mit abnehmendem Durchmesser auf Feuer polieren. Halten Sie die Pipette mit einer Hand fest, stecken Sie die Spitze in die Flamme und entfernen Sie sie schnell. Wiederholen Sie den Vorgang, bis sich die Spitze glättet und der Durchmesser auf den gewünschten Durchmesser (Beurteilung mit Auge) reduziert ist. 3. Reagenzienvorbereitung für die neuronale Gewebedissoziation gemäß den Anweisungen des neuronalen Dissoziationskits Nachdem Sie den Aufschlusspuffer 1 bei Raumtemperatur erwärmt haben, bereiten Sie Enzymmischung 1 vor, indem Sie 50 μl Enzym 1 mit 1,91 ml Puffer 1 mischen, und Enzymmischung 2, indem Sie 15 μl Enzym 2 mit 30 μl Aufschlusspuffer 2 mischen. Die Mischungen reichen aus, um für das gesamte Gehirngewebe der Embryonen verwendet zu werden. Bereiten Sie 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) in HBSS vor, z. B. 0,25 g in 50,0 ml HBSS. 4. Entnahme von Embryonen Autoklavieren Sie zwei gerade feine Pinzetten, eine gebogene Punktzange und eine feine chirurgische Schere und sterilisieren Sie sie vor Gebrauch mit 70%igem Ethanol. Füllen Sie dann die Petrischalen mit HBSS. Euthanasieren Sie eine trächtige E14-E16-Mutter in der CO2 – Kammer und führen Sie eine Zervixluxation durch.HINWEIS: Die folgenden Schritte müssen unter der Haube unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden: Sterilisieren Sie den Bauch mit 70%igem Ethanol. Schneiden Sie die Bauchhöhle von der Schambeinfuge bis zum Processus xiphoideus des Brustkorbs mit einer chirurgischen Schere und einer Pinzette auf. Entnehmen Sie das Gebärmutterhorn und legen Sie es in eine 100 mm große Platte, die mit eiskaltem HBSS gefüllt ist, und waschen Sie es gründlich. Entnehmen und trennen Sie alle Embryonen mit einer feinen Pinzette aus der Gebärmutter. Enthaupten Sie die Embryonen schnell mit einer feinen chirurgischen Schere und/oder Pinzette. Legen Sie die Köpfe in die mit HBSS gefüllte 60-mm-Petrischale. 5. Hypothalamus-Extraktion, -Entnahme und -Gewebedissoziation Platzieren Sie eine feine Pinzette in der Augenhöhle, um das Gehirn zu halten. Entfernen Sie mit der anderen feinen Pinzette die Haut und den Schädel, indem Sie sie abziehen, bis das Gehirn sichtbar ist. Unterscheiden Sie das Gehirn von anderen Geweben anhand seines weißen Aussehens. Haut und Schädel sind rosa und reich an Gefäßen. Entferne das Gehirn aus dem Schädel, indem du die gebogene Pinzette verwendest, und schaube das Gehirn aus den Riechkolben heraus, indem du es auf den Kopf stellst. Jetzt ist der Kortex ventral und der Hypothalamus dorsal auf der oberen Oberfläche sichtbar (Abbildung 1B). Entfernen Sie mit der gebogenen Pinzette die Schicht der Hirnhäute und Blutgefäße, bis das Gehirn weiß und klar erscheint. Trennen Sie mit der gekrümmten Zange den Hypothalamusbereich vom Rest des Gehirns. Schneiden Sie den Hypothalamus in 3-4 kleine Stücke und geben Sie die Stücke mit einer Pipette in ein 15-ml-Röhrchen. Wiederholen Sie die Schritte für die anderen Embryonen, während der Eileiter auf Eis liegt. Füllen Sie das Röhrchen mit 6,0 ml HBSS und lassen Sie das Gewebe absetzen, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie Enzymmischung 1 hinzu. Mischen und rühren Sie das Röhrchen vorsichtig, um das Gewebe zu verhindern. Inkubieren Sie das Röhrchen 15 Minuten lang in einem 37 °C warmen Wasserbad und schütteln Sie das Gewebe alle 5 Minuten, um das Gewebe zu resuspendieren. Nach 15 Minuten 30 μl Enzymmischung 2 hinzufügen. Dissoziation des Hirngewebes mit der Pipette Pasteur mit dem größten Durchmesser (<1 mm). 10x auf- und abpipettieren, ohne Blasen zu bilden. 10 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren. Bewegen Sie den Schlauch vorsichtig, um das Gewebe alle 5 Minuten zu resuspendieren. Nach 10 Minuten die restlichen 15 μl Enzymmischung 2 hinzufügen. Dissoziieren Sie das Gewebe 10x mit den beiden anderen feuerpolierten Pipetten mit abnehmendem Durchmesser nach oben und unten, ohne Blasen zu bilden. In das Röhrchen mit dem dissoziierten Gewebe werden sofort 10,0 ml HBSS-0,5% BSA gegeben und bei 300 × g 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Saugen Sie den Überstand ab und resuspendieren Sie das Zellpellet in 1,0 ml HBS-0,5% BSA. 6. Zählung der Zellen Verdünnen Sie die Zellsuspension im Verhältnis 1:5 mit HBSS-0,5% BSA. 10 μl der verdünnten Zellsuspension in eine Neubauer-Zählkammer geben. Zählen Sie unter einem Hellfeldmikroskop nur die Zellen, die sich in den Eckquadraten der vier Kammer befinden. Berechnen Sie den Durchschnitt und multiplizieren Sie ihn mit 5 × 104.HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass >106 Zellen vorhanden sind, um mit der Zellisolierung fortzufahren. Die optimale Zellzahl ist 107. 7. Negative Auswahl HINWEIS: Die negative Selektion ermöglicht es Benutzern, eine reine primäre Neuronenkultur zu erhalten, indem neuronale und nicht-neuronale Zellen getrennt werden. Verwenden Sie vorgekühlte Lösungen. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300 × g für 3 min (die Zentrifugation kann auf bis zu 10 min verlängert werden). Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie das Pellet auf eine Konzentration von 10bis 7 Zellen in 80 μl HBSS-0,5 % BSA. 20 μl Nicht-neuronaler Zell-Biotin-Antikörper-Cocktail zugeben und 5 Minuten bei 4 °C inkubieren. Waschen Sie die Zellen, um den freien Antikörper zu entfernen, mit 2,0 ml HBSS-0,5% BSA und zentrifugieren Sie sie 3 Minuten lang bei 300 × g . Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie das Pellet in 80 μl HBSS-0,5% BSA. Fügen Sie 20 μl Antibiotin-Mikrokügelchen hinzu, mischen Sie sie gründlich und inkubieren Sie 10 Minuten lang bei 4 °C. Fügen Sie 0,5 ml HBSS-0,5% BSA für bis zu 107 Zellen hinzu und warten Sie, bis die Magnetsäule fertig ist. 8. Magnetische Trennung, negative Selektion HINWEIS: Die magnetische Trennung ist ein entscheidender Schritt, der die Trennung der nicht-neuronalen Zellen von den neuronalen Zellen ermöglicht. Die Probe, die neuronale und nicht-neuronale Zellen enthält, wird durch das Magnetfeld geleitet und die nicht-neuronalen Zellen, die an einen Biotin-Antikörper-Magnet-Bead-Komplex gebunden sind, werden in der Säule gefangen (Abbildung 1C). Die freien neuronalen Zellen werden durch die Säule eluiert und in einem 15-ml-Röhrchen gesammelt. Bereiten Sie den Ständer (im Kit enthalten) mit dem Separator und der MS-Säule vor, wie in Abbildung 1C gezeigt. Öffnen Sie die Säule und stellen Sie den Ständer erst auf, wenn die Zellen zum Trennen bereit sind. Spülen Sie die Säule mit 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Warten Sie, bis die Lösung nicht mehr tropft. Um neuronale Zellen zu sammeln, legen Sie ein 15-ml-Röhrchen unter die Säule und führen Sie 0,5 ml der Zellsuspension durch die Säule. Sammeln Sie das Eluat im Röhrchen, bis es nicht mehr tropft. Um verbleibende neuronale Zellen einzufangen, waschen Sie die Säule 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Um nicht-neuronale Zellen zu sammeln, entfernen Sie die Säule aus dem Magneten und legen Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen. Geben Sie 1,0 ml HBSS-0,5 % BSA in die Säule und verwenden Sie den Kolben, um die magnetisch markierten nicht-neuronalen Zellen zu sammeln. Zentrifugieren Sie die neuronalen und nicht-neuronalen Zellen bei 300 × g für 3 Minuten. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie die Zellen in 1,0 ml HBSS-0,5% BSA. Zählen Sie die Zellen wie zuvor in Abschnitt 6 beschrieben. Bei Bedarf werden die nicht-neuronalen Zellen in einer 24-Well-Platte plattiert. Andernfalls verwerfen Sie sie. 9. Positive Selektion HINWEIS: Sobald eine reine neuronale Zellsuspension erhalten wurde, wird eine positive Selektion durchgeführt, um die Zielzellen zu isolieren. Zellen können isoliert werden, indem ein spezifischer Biotin-konjugierter Antikörper für ein Oberflächenantigen verwendet wird. Der Antikörper wird von Antibiotin-Magnetkügelchen erkannt. Durch das Fließen der Zellsuspension durch die Säule werden nur die interessierenden Zellen im Magnetfeld gefangen. Zentrifugieren Sie die reine neuronale Zellsuspension bei 300 × g für 3 min. Saugen Sie den Überstand vorsichtig an und resuspendieren Sie das Pellet in 80 μl HBSS-0,5% BSA. Fügen Sie den spezifischen Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu und inkubieren Sie ihn 10 Minuten lang bei 4 °C.HINWEIS: Wenn Zellen gesucht werden, die LepR exprimieren, empfehlen wir einen biotinylierten Maus-Leptin-R-Antikörper (siehe Materialtabelle) in einer Konzentration von 0,50 μg/106 Zellen. Waschen Sie den überschüssigen Antikörper mit 2,0 ml HBSS-0,5% BSA ab und zentrifugieren Sie ihn 3 Minuten lang bei 300 × g . Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie das Pellet in 80 μl HBSS-0,5% BSA und fügen Sie 20 μl Anti-Biotin-Mikrokügelchen hinzu. Bei 4 °C 10 min inkubieren. Alle 10 bis 7 Zellen 0,5 ml HBSS-0,5 % BSA zugeben und warten,bis die magnetische Säule fertig ist. 10. Magnetische Trennung, positive Selektion Bereiten Sie den Ständer mit dem Separator und der MS-Säule vor. Spülen Sie die MS-Säule mit 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Warten Sie, bis das Tropfen aufhört. Platzieren Sie ein 15-ml-Röhrchen unter der Säule, leiten Sie 0,5 ml der Zellsuspension durch die Säule und sammeln Sie das Eluat, das die unspezifischen neuronalen Zellen enthält. Um die Säule von verbleibenden unspezifischen neuronalen Zellen zu reinigen, waschen Sie sie mit 3 x 0,5 ml HBSS-0,5% BSA. Entfernen Sie die Säule vom Magneten, legen Sie sie in ein neues 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 1,0 ml HBSS-0,5% BSA hinzu. Verwenden Sie den Kolben, um die Zielzellen auszuspülen. Beide Röhrchen bei 300 × g für 3 min zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und suspendieren Sie ihn wieder in 0,5 ml Beschichtungsmedium. Zählen Sie die Zellen wie zuvor in Abschnitt 6 beschrieben. Platte sowohl Zielzellen als Positivkontrolle als auch unspezifische Zellen als Negativkontrolle bei einer Dichte von 120.000 bis 200.000 Zellen/mm3 in der zuvor wie in Abschnitt 2 beschriebenen 24-Well-Platte und Inkubation bei 37 °C bei 5 % CO2, 9 % O2 und 95 % Luftfeuchtigkeit für12 Stunden. 11. Pflege der Zellkultur Bereiten Sie 20 ml Nährmedium mit 19,2 ml neuronalem Kulturmedium, 400 μl B27-Präparat (aus einem 50-fachen Stamm), 200 μl Glutamin (aus einem 200-μM-Stamm) und 100 μl Penicillin/Streptomycin (aus einem 200-fachen Stamm) vor. Ersetzen Sie das Beschichtungsmedium von der 24-Well-Platte, die neuronale oder nicht-neuronale Zellen enthält. Mit 2 x 1,0 ml HBSS waschen. Fügen Sie 1,0 ml Nährmedien hinzu. Aktualisieren Sie das Medium alle 2/3 Tage, indem Sie 0,5 ml alte Medien durch 0,5 ml frische Medien ersetzen.HINWEIS: Zellen können in Kultur gehalten und bis zu 21 Tage in vitro verwendet werden (DIV21). 12. Immunfluoreszenzfärbung von Neuronen Zwölf Stunden vor der Färbung wird eine Lösung aus 50/50 Methanol und Aceton hergestellt und über Nacht bei -20 °C abgekühlt. Waschen Sie die Neuronen in der 24-Well-Platte mit 2 x 1,0 ml 1x phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) für 5 Minuten. Ersetzen Sie die PBS-Lösung durch 1,0 ml der 50/50-Lösung und inkubieren Sie sie 20 Minuten lang in Eis. Mit 1x PBS für 3 x 5 Min. waschen. Blockieren Sie die Neuronen mit 3% BSA in 1x PBS für 1 h bei Raumtemperatur. Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung in 3% BSA in 1x PBS unter Verwendung der in den Anweisungen des Herstellers angegebenen Antikörperkonzentration vor. Die verwendeten Antikörper und Konzentrationen sind in der Materialtabelle aufgeführt. Die blockierende Lösung wird durch die primäre Antikörperlösung ersetzt und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Waschen Sie die Zellen für 3 x 10 min mit 1x PBS. Bereiten Sie die Sekundärantikörperlösung mit 3% BSA in 1x PBS unter Verwendung der Konzentrationen der Antikörper gemäß den Anweisungen des Herstellers vor. Die verwendeten Sekundärantikörper sind in der Materialtabelle aufgeführt. Inkubieren Sie die Zellen mit der sekundären Antikörperlösung bei Raumtemperatur für 1 h. Waschen Sie die Zellen für 3 x 10 min mit 1x PBS. Lassen Sie die Neuronen während des Montagevorgangs in 1x PBS. Geben Sie einen kleinen Tropfen Eindeckmedium (mit oder ohne 4′,6-Diamidino-2-phenylindol zur nuklearen Identifizierung) auf den Objektträger. Ziehen Sie mit einer Pinzette ein Deckglas mit Neuronen heraus und klopfen Sie die Seite des Deckglases auf ein Papiertuch, um das überschüssige PBS zu trocknen. Drehen Sie das Deckglas auf das Eindeckmedium und stellen Sie sicher, dass die Neuronen zu den Objektträgern zeigen. Drücken und entfernen Sie das überschüssige Eindeckmedium vorsichtig mit Seidenpapier. Die Objektträger können mit einem Hellfeld- oder Konfokalmikroskop analysiert werden.