Een eenvoudig, snel en gedeeltelijk geautomatiseerd protocol voor de isolatie van afzonderlijke kernen uit ingevroren zoogdierweefsels voor sequencing van één kern

Alle dierproeven werden uitgevoerd met de goedkeuring van de kantonnale veterinaire autoriteit van Basel-Stadt in strikte overeenstemming met de Zwitserse federale regelgeving inzake dierenbescherming of met de goedkeuring van de institutionele commissie voor dierenverzorging en -gebruik in overeenstemming met de Duitse dierenwelzijnswet. 1. Voorbereiding van weefsels en reagens/instrumenten Reiniging en voorbereiding van het instrumentReinig werkbladen en pincetten met 70% ethanol en RNase-ontsmettingsoplossing. Koel de centrifuges voor tot 4 °C. Koel de nuclei isolatiepatronen voor in de koelkast op 4 °C gedurende ten minste 30 min. Start de robotdissociator en zet de koeling aan door de schuifregelaar rechtsboven in het scherm op koelen te zetten en door erop te klikken om te beginnen met koelen zodat de schuifregelaar oranje lijkt. Controleer of de bijgevoegde fles met nuclei storage reagens (NSR) en de fles met nuclei isolation buffer (NIB) voldoende vloeistof over hebben en goed zijn gekoeld. Zet een doos van polystyreenschuim gevuld met droogijs en koel petrischaaltjes en scalpelmesjes voor op droogijs. Buffer voorbereidingBereid de 1,5 M sucrosekussenoplossing (SCS) zoals weergegeven in tabel 1. Verdeel de SCS in aliquots van 500 μl in DNase/RNase-buisjes van 2 ml om vier SCS-aliquots van 500 μl per monster te verkrijgen. Bewaar de aliquots op ijs tot verder gebruik. In het geval van verwerking van hersenweefsel, bereid in plaats daarvan een 18% silica-colloïdoplossing zoals beschreven in tabel 2, door de silica-colloïdstockoplossing in NSR te verdunnen en RNaseremmer toe te voegen. Bereid 3 ml 18% silica-colloïdoplossing per monster en bewaar deze op ijs. 2. Weefselhomogenisatie en isolatie van kernen Haal het monster uit de vriezer van -80 °C en plaats het onmiddellijk op droogijs. Snijd het monster op een voorgekoelde petrischaal of metalen plaat op droogijs met een voorgekoelde scalpel in een stuk van 15-50 mg (als het nog niet de juiste maat heeft). Zorg ervoor dat u het monster in de juiste richting snijdt, zodat het monster nog steeds representatief is voor de orgaanstructuren van belang.OPMERKING: Met dit protocol is 15-50 mg de optimale steekproefomvang voor nucleaire extractie. Om na het opruimen een goede opbrengst te behalen, wordt een steekproefomvang van minimaal 25 mg aanbevolen. Voor kleinere monsters zijn speciale cartridges beschikbaar die zijn geoptimaliseerd voor het verwerken van kleine inputs met de robotdissociator. Kleine input nuclei isolatiecartridges werden gebruikt om weefselmonsters met een gewicht van slechts 4 mg te dissociëren met voldoende opbrengst voor stroomafwaartse RNA-sequencing van enkele kernen. Tabel 3 geeft een voorbeeld van de opbrengst van kernen met behulp van de cartridge met lage invoer uit leverweefsel van ratten. Haal de nuclei-isolatiepatroon uit de koelkast, pak het uit, verwijder de molen en pipetteer 15 μL RNaseremmer (40 E/μL) op de bodem van het patroon.OPMERKING: Tijdens de extractie van de kernen voegt de robotdissociator NIB en NSR toe aan de cartridge tot een totaal volume van 3 ml (met het protocol voor het extraheren van kernen met een laag volume). Door voorafgaand aan de extractie 15 μL RNaseremmer (40 E/μL) aan de cartridge toe te voegen, heeft de suspensie de gewenste RNAse-remmerconcentratie van 0,2 E/μL. Plaats het weefselmonster met een pincet op de bodem van de patroon. Plaats het monster niet precies in het midden van de cartridge om een optimale verstoringsefficiëntie te hebben. Selecteer Een protocol uitvoeren op het instrument en klik op de optie Nuclei in de linkerbovenhoek.Selecteer in het menu het Low Volume Nuclei Isolation-protocol en controleer of de verstoringssnelheid is ingesteld op hoog door op Wijzigen te klikken. Laad de cartridge in het instrument door de deur te openen en het podium uit te schuiven door de rode knop op te tillen. Plaats de cartridge op de daarvoor bestemde plaats, draai aan de cartridgevergrendeling en schuif deze in de werktafel totdat de rode knop op zijn plaats klikt. Sluit de deur en start de kernextractie op het instrument door op Volgende te klikken. De run duurt ongeveer 7 min. Zodra de run is voltooid, verwijdert u de cartridge uit het instrument door de rode knop op te tillen en de tafel eruit te trekken. Plaats de patroon onmiddellijk op ijs. Ga voor alle weefsels behalve de hersenen verder met stap 3.1. Ga voor hersenmonsters direct door naar stap 3.2. 3. Opruimen van kernen Sucrose gradiënt opruimenOPMERKING: Voor hersenweefsel slaat u deze stap over en gaat u direct naar stap 3.2. Alle opruimstappen worden uitgevoerd op ijs om de afbraak van RNA te minimaliseren. Buffers en buizen en de centrifuges moeten worden voorgekoeld. Alle hersuspensie- en mengstappen worden alleen uitgevoerd door zorgvuldig pipetteren, omdat vortexen de kwaliteit en integriteit van de kernen in gevaar kunnen brengen.Prik voorzichtig met een pipetpunt in de ronde folie op de dissociatorpatroon.OPMERKING: Na dissociatie heeft de resulterende kernsuspensie een volume van ongeveer 2 ml. Om het opruimen van de sucrosegradiënt te vergemakkelijken, verdeelt u de nuclei-suspensie in twee aliquots van 900 μL, wat resulteert in een totaal volume van 1,8 ml nuclei-suspensie dat tijdens het opruimen wordt gebruikt. Verwijder het eerste aliquot van 900 μl van de nucleisuspensie uit de patroon en voeg het toe aan een SCS-aliquot van 500 μl dat eerder in een buisje van 2 ml is bereid. Meng goed door te pipetteren tot het mengsel homogeen is. Verwijder het 1400 μl kernsuspensie – SCS-mengsel en breng het voorzichtig aan op een nieuw SCS-aliquot van 500 μl door de buis schuin te houden en het mengsel druppelsgewijs toe te voegen, zodat een duidelijk zichtbare fasescheiding ontstaat (zie figuur 1A). Sluit de buis voorzichtig en plaats deze terug op ijs zonder de fasescheiding te verstoren. Herhaal de stappen 3.1.2-3.1.4 met het tweede aliquot van 900 μl suspensie en een nieuw SCS-aliquot om twee buisjes van 2 ml per monster te hebben met een duidelijk zichtbare fasescheiding voor gradiëntcentrifugatie. Voeg de buisjes voorzichtig toe aan een voorgekoelde centrifuge en draai ze gedurende 15 minuten bij 4 °C op 13.000 x g . Bereid intussen de in tabel 4 beschreven NSR voor door de RNaseremmer toe te voegen aan een aliquotum van NSR. Bereid 1 ml NSR per monster.OPMERKING: Op dit punt kunnen de eencellige genexpressie-reagensgelkorrels uit de vriezer van -80 °C worden verwijderd, waardoor ze op kamertemperatuur (RT) kunnen worden gebracht, en de oligo van de sjabloonschakelaar kan opnieuw worden gesuspendeerd in een lage TE-buffer. Verwijder na het centrifugeren het supernatans uit beide buizen zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet voorzichtig in 50 μL ijskoude NSR volgens de aanbeveling van de fabrikant. Pool de twee pellets van hetzelfde monster in een nieuwe buis van 1,5 ml en voeg 900 μL ijskoude NSR toe tot een totaal volume van 1 ml. Goed mengen door te pipetteren. Centrifugeer het monster bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C met een rotorcentrifuge met zwenkbare emmer.OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om een rotor met zwenkbare emmer te gebruiken om het verlies van kernen te minimaliseren, vooral wanneer de opbrengst van de kernen naar verwachting laag zal zijn of wanneer u begint met kleine hoeveelheden weefsel. Bereid in de tussentijd 500 μL per monster van 1x PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) met 0,04% runderserumalbumine (BSA) en 0,2 E/μL RNaseremmer zoals beschreven in tabel 5. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet weg te gooien en resuspendeer de pellet in 100 μL PBS-oplossing zoals hierboven bereid (1x PBS + 0,04% BSA + RNaseremmer bij 0,2 E/μL).OPMERKING: Voor kleine weefselmonsters kan de kernconcentratie laag zijn en daarom wordt aanbevolen om de pellet te resuspenderen in slechts 50 μL PBS-oplossing om voldoende hoge concentraties te garanderen voor RNA-sequencing met één kern. Ga direct door naar stap 4. Silica colloïde gradiënt opruimenOPMERKING: Voor hersenweefsel is een silica-colloïdgradiënt geschikter dan een sucrose-gradiënt om myeline en puin uit de kernsuspensie te verwijderen. Alle opruimstappen worden uitgevoerd op ijs om de afbraak van RNA te minimaliseren. Buffers en buizen, evenals de centrifuges, moeten worden voorgekoeld. Alle hersuspensie- en mengstappen worden alleen uitgevoerd door zorgvuldig pipetteren, omdat vortexen de kwaliteit en integriteit van de kernen in gevaar kunnen brengen.Prik voorzichtig met een pipetpunt in de ronde folie op de dissociatorpatroon. Verwijder de nuclei-suspensie uit de patroon en voeg deze toe aan een buisje van 5 ml. Centrifugeer bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een voorgekoelde centrifuge. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren en resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude 18% silica-colloïdoplossing. Voeg nog eens 2 ml 18% silicacolloïdoplossing toe tot een totaal volume van 3 ml en meng goed door te pipetteren. Centrifugeer het monster bij 700 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een rotor met zwenkbare emmer en de rem uitgeschakeld. Bereid in de tussentijd de in tabel 4 beschreven NSR voor door de RNaseremmer toe te voegen aan een aliquotum NSR. Bereid 1 ml NSR per monster.OPMERKING: Op dit punt kunnen de eencellige genexpressie-reagensgelkorrels uit de vriezer van -80 °C worden verwijderd, waardoor deze in evenwicht kan komen met RT en de sjabloonschakeloligo kan worden geresuspendeerd in een lage TE-buffer. Haal het monster voorzichtig uit de centrifuge zonder de myelinelaag die erop drijft te verstoren. Verwijder eerst de myelinelaag van de bovenkant en gooi deze weg; Verwijder vervolgens voorzichtig het hele supernatans zonder de pellet te verstoren.OPMERKING: De myelinelaag kan eenvoudig worden verwijderd door een steriel pluisvrij doekje om een pipetpunt van 1 ml te wikkelen om de myelinelaag samen met 1-2 ml van het supernatant op te zuigen. Resuspendeer de pellet in 1 ml ijskoude NSR volgens de aanbeveling van de fabrikant. Centrifugeer het monster bij 500 x g gedurende 5 minuten bij 4 °C in een centrifuge met een rotor met een zwenkbare emmer.OPMERKING: Het wordt ten zeerste aanbevolen om een rotor met zwenkbare emmer te gebruiken om het verlies van kernen te minimaliseren, vooral wanneer de opbrengst van de kernen naar verwachting laag zal zijn of wanneer u begint met kleine hoeveelheden weefsel. Bereid in de tussentijd 500 μL per monster van 1x PBS (zonder Ca2+ en Mg2+) met 0,04% runderserumalbumine (BSA) en 0,2 E/μL RNaseremmer zoals beschreven in tabel 5. Verwijder het supernatans voorzichtig zonder de pellet te verstoren en resuspendeer het monster in 100 μL PBS-oplossing zoals hierboven bereid (1x PBS + 0,04% BSA + RNaseremmer bij 0,2 E/μL).OPMERKING: Voor kleine weefselmonsters kan de kernconcentratie laag zijn en daarom wordt aanbevolen om de pellet te resuspenderen in slechts 50 μL PBS-oplossing om voldoende hoge concentraties te garanderen voor RNA-sequencing met één kern. 4. Tellen Verdun voor elk te tellen monster 10 μl kernsuspensie in 20 μl PBS-oplossing om een verdunning van 1:3 te verkrijgen. Voeg voor het tellen 25 μL propidiumjodide (PI)-kleuroplossing toe aan een mengputje van de fluorescerende telplaat. Voeg 25 μl van de verdunde kernsuspensie toe en meng goed door te pipetteren. Breng het gekleurd monster van 50 μl over van de mengput naar de laadput. Laad het telplaatje op de cellenteller en start de telling.OPMERKING: Het aantal kernen wordt genomen uit het rode fluorescerende kanaal met een belichtingstijd van 700 ms. Dit kanaal is geoptimaliseerd om een nauwkeurige telling van de kernen te krijgen door vergelijking met handmatige telling met een Neubauer-kamer en Trypan Blue-kleuring onder de microscoop. Bij hoge concentraties staan de kernen erg dicht bij elkaar, waardoor het voor de software moeilijk is om ze te scheiden. In dit geval wordt aanbevolen het monster in een geschikte verdunning te tellen. De integriteit van de kernen en de reinheid kunnen worden beoordeeld aan de hand van het heldere veldbeeld of onder een microscoop. Verdun de monsters met PBS (1x PBS + 0,04% BSA + RNaseremmer bij 0,2 E/μL) tot de gewenste concentratie voor RNA-sequencing met één kern.OPMERKING: Concentraties tussen 700-1.200 nuclei/μL worden als optimaal beschouwd voor RNA-sequencing met één kern. Lagere celconcentraties, zoals 700 kernen/μL, kunnen leiden tot verminderde achtergrondbesmetting door omringend RNA. 5. Voorbereiding van de bibliotheek Voer RNA-sequencing met één kern uit met de reagentia voor genexpressie van één cel met behulp van het protocol van de fabrikant dat gericht is op een kernherstel van 8000-10.000 kernen per monster. 6. Volgorde aanbrengen Zet de volgorde van de bibliotheken met de gewenste sequentiediepte met paired-end, dubbele indexering en de volgende sequencing-lezingen: Read 1: 28 cycli, i7 Index: 10 cycli, i5 Index: 10 cycli en Read 2: 90 cycli.