Cribado de modificación de histonas mediante cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo
Summary
Un flujo de trabajo analítico basado en cromatografía líquida, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para un análisis “ascendente” de alta confianza y altamente reproducible de las modificaciones e identificación de histonas en función de los parámetros principales (tiempo de retención [RT], sección transversal de colisión [CCS] y relación masa-carga [m/z] precisa).
Abstract
Las proteínas histonas son muy abundantes y se conservan entre los eucariotas y desempeñan un papel importante en la regulación génica como resultado de estructuras conocidas como modificaciones postraduccionales (PTM). La identificación de la posición y la naturaleza de cada PTM o patrón de PTM en referencia a factores externos o genéticos permite correlacionar estadísticamente esta información con respuestas biológicas como la transcripción, replicación o reparación del ADN. En el presente trabajo se describe un protocolo analítico de alto rendimiento para la detección de histonas PTM a partir de muestras biológicas. El uso de cromatografía líquida complementaria, espectrometría de movilidad de iones atrapados y espectrometría de masas de tiempo de vuelo (LC-TIMS-ToF MS/MS) permite la separación y la asignación de PTM de las modificaciones biológicamente más relevantes en un solo análisis. El enfoque descrito aprovecha los desarrollos recientes en la adquisición de datos dependientes (DDA) utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad, seguida de la fragmentación secuencial y la disociación inducida por colisiones. Los PTM de Histone se asignan con confianza en función de su tiempo de retención, movilidad y patrón de fragmentación.
Introduction
En las células eucariotas, el ADN se empaqueta como cromatina en unidades funcionales llamadas nucleosomas. Estas unidades están compuestas por un octámero de cuatro histonas centrales (dos de H2A, H2B, H3 y H4)1,2,3,4. Las histonas se encuentran entre las proteínas más abundantes y mejor conservadas en los eucariotas, que son en gran parte responsables de la regulación génica5. Las modificaciones postraduccionales de histonas (PTM) desempeñan un papel importante en la regulación de la dinámica de la cromatina y en la preparación de diversos procesos biológicos, como la transcripción, replicacióny reparación del ADN. Los PTM se encuentran principalmente en la superficie accesible de las regiones N-terminales de las histonas que están en contacto con el ADN 3,7. Sin embargo, las modificaciones de la cola y el núcleo influyen en la estructura de la cromatina, alterando las interacciones entre nucleosomas y reclutando proteínas específicas 3,8.
Un reto actual durante la proteómica basada en cromatografía líquida y espectrometría de masas (LC-MS) es la posible coelución de analitos de interés. En el caso de los análisis dependientes de los datos (DDA), esto se traduce en la pérdida potencial de varios iones precursores durante el proceso de adquisición de MS/MS9. Los instrumentos de tiempo de vuelo (ToF) adquieren espectros a muy alta frecuencia 9,10 (hasta decenas de kHz)11; esto los hace capaces de escanear rápidamente el total de iones precursores dentro de una muestra compleja (MS1), lo que promete una sensibilidad óptima y velocidades de secuenciación MS/MS (hasta 100 Hz)9 y los hace ideales para el análisis de muestras biológicas10. Sin embargo, la sensibilidad disponible a estas altas velocidades de exploración está limitada por la velocidad MS/MS9. Para mitigar estas limitaciones, se utilizó la adición de espectrometría de movilidad de iones atrapados (TIMS) en combinación con un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar ortogonal (qToF). En TIMS, todos los iones precursores se acumulan en tándem y se eluyen en función de su movilidad, en lugar de seleccionar masas precursoras individuales con un cuadrupolo9. La fragmentación en serie de acumulación paralela (PASEF) permite cientos de eventos MS/MS por segundo sin pérdida de sensibilidad9.
El objetivo principal de este trabajo fue mostrar los desarrollos recientes de DDA utilizando la acumulación paralela en la trampa de movilidad seguida de fragmentación secuencial y disociación inducida por colisión (CID). Los PTM de Histone se asignaron con confianza en función de sus tiempos de retención (RT), movilidades y patrones de fragmentación.
Protocol
Representative Results
Discussion
Las histonas son proteínas básicas que regulan la estructura de la cromatina interactuando con el ADN en forma de octámeros formados por las cuatro histonas centrales (dos de H2A, H2B, H3 y H4)20. Las histonas contienen numerosos residuos de lisina y arginina, que se modifican fácilmente, lo que da lugar a extensos PTM que alteran la química de la cromatina al influir en la función de las histonas o al unirse a otras proteínas celulares21. Los PTM pueden provocar res…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este material se basa en el trabajo apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. HRD-1547798 y la Subvención No. HRD-2111661. Estas subvenciones de la NSF fueron otorgadas a la Universidad Internacional de Florida como parte del Programa de los Centros de Excelencia en Investigación en Ciencia y Tecnología (CREST). Esta es la contribución número 1672 del Instituto de Medio Ambiente, un programa preeminente de la Universidad Internacional de Florida. El Instituto Nacional de Salud prestó apoyo adicional en el marco de la subvención No. R21AI135469 a Francisco Fernández-Lima y a la Subvención No. R01HD106051 a Benjamín A. García, así como por la Fundación Nacional de Ciencias bajo la Subvención No. CHE-2127882 a Benjamín A. García. Los autores desean agradecer el apoyo inicial del Dr. Mario Gómez Hernández durante el desarrollo inicial del método.
Materials
| -80 °C Freezer | |||
| 1x Phosphate Buffered Saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | Animal Origin-Free |
| 1 mL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060710 | Finntip Flex 1000 μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-282-300 | Use these tubes for the simple and safe processing of sample volumes up to 1.5 mL |
| 10 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060100 | Finntip Flex, 10 μL, nonsterile, non-filtered, racked |
| 10% NP-40 | Thermo Fisher Scientific | 28324 | NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution |
| 10x Dulbecco’s PBS without Ca2+/Mg2+ | (Mediatech) | MT21031CM | |
| 15 mL Conical Tubes | Corning | 352196 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 200 µL Gel-Loading Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 02-707-138 | Fisherbrand Gel-Loading Tips, 1–200 μL |
| 200 µL Pipette Tips | Thermo Fisher Scientific | 94060310 | Finntip Flex 200μL, nonsterile, nonfiltered, racked tips |
| 2x Laemmli Sample Buffer | Bio-Rad | 1610737 | Premixed protein sample buffer for SDS-PAGE |
| 50 mL Conical Tubes | Corning | 352070 | Falcon Conical Centrifuge Tubes |
| 96-well flat bottom plate | Thermo Fisher Scientific | 12565501 | |
| 96-well plate, V-Bottom 600 μL | Axygen | P-DW-500-C-S | |
| Acetone | Sigma Aldrich | 179124 | ACS reagent, ≥99.5% |
| Acetonitrile (ACN) | Thermo Fisher Scientific | A998 | HPLC, Fisher Chemical |
| Acetonitrile with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS120 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
| AEBSF | Thermo Fisher Scientific | 328110500 | AEBSF hydrochloride, 98% |
| Ammonium bicarbonate, NH4HCO3 | Sigma Aldrich | 09830 | BioUltra, ≥99.5% (T) |
| Ammonium hydroxide solution, NH4OH | Sigma Aldrich | AX1303 | Meets ACS Specifications, Meets Reagent Specifications for testing USP/NF monographs GR ACS |
| Argon (Ar) | Airgas | AR HP 300 | |
| BEH C18 HPLC column | Waters | 186003625 | XBridge Peptide BEH C18 Column, 300 Å, 5 µm, 4.6 mm X 250 mm, 1K–15K |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A7906 | Heat shock fraction, pH 7, ≥98% |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma Aldrich | C4901 | Anhydrous, powder, ≥97% |
| Cell dissociation buffer | Thermo Fisher Scientific | 13151014 | |
| Ceramic scoring wafer | Restek | 20116 | |
| Compass DataAnalysis 6.0 | Bruker Datonics | ||
| Compass HyStar 6.2 | Bruker Daltonics | ||
| Compass IsotopePattern | Bruker Daltonics | ||
| Compass timsControl 4.1 | Bruker Daltonics | ||
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Bio-Rad | 1610436 | |
| Deep Well, 96-Well Microplate, 2.0 mL | Thermo Fisher Scientific | 89237526 | |
| Disposable Cell Lifters | Thermo Fisher Scientific | 08100240 | Fisherbrand Cell Lifters; Disposable lifters quickly remove cell layers |
| Disposable Pellet Pestles | Thermo Fisher Scientific | 12-141-363 | Fisherbrand Pellet Pestles; Resuspend protein and DNA pellets or grind soft tissue in microcentrifuge tubes |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher Scientific | P2325 | 1 M |
| Formic acid (FA) | Sigma Aldrich | 695076 | ACS reagent, ≥96% |
| Fused silica capillary 75 μm ID x 363 μm OD | (Molex (Polymicro) | TSP075375 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo Fisher Scientific | A38S | Acetic Acid, Glacial (Certified ACS), Fisher Chemical |
| Glass Pasteur Pipettes | Sigma Aldrich | BR747725-1000EA | |
| High-Performance Liquid Chromatograph | Shimadzu | Shimadzu Prominence 20 HPLC UFLC System | |
| Hydrochloric acid, HCl | Sigma Aldrich | 258148 | ACS reagent, 37% |
| Hypercarb 30-40 μm Carbon 150–300 Å | Thermo Fisher Scientific | 60106-402 | |
| Hypersep cartridge | Thermo Fisher Scientific | 60109-404 | |
| LC/MS Calibration Standard, for ESI-ToF | Agilent | G1969-85000 | TuningMix |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Sigma Aldrich | M8266 | Anhydrous, ≥98% |
| Methanol, for HPLC | Thermo Fisher Scientific | A454 | Optima for HPLC, Fisher Chemical |
| Microcentrifuge Tube Adapters | GL Sciences | 501021514 | |
| Microcystin | Thermo Fisher Scientific | 50-200-8727 | Enzo Life Sciences Microcystin-LA |
| MS sample vial, LaPhaPack, Snap, 12 mm x 32 mm | LEAP PAL Parts | LAP.11190933 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific | model: ND3300 | |
| Nitrogen (N2) | Airgas | NI UHP300 | |
| PEAKS Studio X+ | Bioinformatic Solutions | ||
| pH indicator strips, Instachek | Micro Essential Lab | JR-113 | Model: Hydrion |
| Potassium chloride, KCl | Sigma Aldrich | P3911 | ACS reagent, 99.0%–100.5% |
| Pressure Injection Cell | Next Advance | model: PC77 | |
| Propionic Anhydride | Sigma Aldrich | 8.00608 | For synthesis |
| Refrigerated Centrifuge (700–18,000 x g) | NuAire, model: Nuwind | NU-C200V | |
| Reprosil-Pur 120 C18-AQ 3 μm, 3 g | ESI Source Solutions | r13.aq.0003 | |
| SDS-PAGE Gels | Bio-Rad | 4569035 | Any kD precast polyacrylamide gel, 8.6 cm × 6.7 cm (W × L), for use with Mini-PROTEAN Electrophoresis Cells |
| Sodium butyrate | Thermo Fisher Scientific | A11079.06 | 98+% |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | ACS reagent, ≥99.0% |
| SPE disk, C18 | VWR | 76333-134 | Empore SPE disk, C18, CDS Analytical, 90 mm x 0.5 mm, 12 µm |
| SpeedVac+ vacuum pump and plate rotor | Savant | model: SC210A | |
| Sucrose | Millipore | 1.07651 | suitable for microbiology |
| Sulfuric acid, H2SO4 | Sigma Aldrich | 339741 | 99.999% |
| TIMS-ToF Mass Spectrometer | Bruker Daltonics | model Tims tof ms | |
| Trichloroacetic acid solution, TCA | Sigma Aldrich | T0699 | 6.1 N |
| Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich | 302031 | Suitable for HPLC, ≥99.0% |
| Triversa Nanomate | Advion | model: TR263 | |
| TrypsinProtease, MS Grade | Thermo Fisher Scientific | 90057 | |
| Tube rotator | Thermo Fisher Scientific | 88881001 | |
| Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 88880017 | |
| Water with 0.1% Formic acid (v/v), LC/MS Grade | Thermo Fisher Scientific | LS118 | Optima LC/MS Grade, Thermo Scientific |
Referencias
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