यह पत्र ब्रैडफोर्ड परख और एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में एक स्मार्टफोन का उपयोग करके प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है। स्मार्टफोन से ली गई माइक्रोप्लेट की तस्वीर से निकाले गए रंग डेटा का उपयोग करके नमूनों में प्रोटीन के स्तर को निर्धारित किया जा सकता है।
प्रोटीन की मात्रा का ठहराव जीवन विज्ञान अनुसंधान में एक आवश्यक प्रक्रिया है। कई अन्य तरीकों में, ब्रैडफोर्ड परख सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले में से एक है। इसकी व्यापकता के कारण, ब्रैडफोर्ड परख की सीमाओं और लाभों को पूरी तरह से रिपोर्ट किया गया है, जिसमें इसके प्रदर्शन को बेहतर बनाने के लिए मूल विधि के कई संशोधन शामिल हैं। मूल विधि के परिवर्तनों में से एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में स्मार्टफोन कैमरे का उपयोग है। ब्रैडफोर्ड परख की स्थितियों में मौजूद कूमासी ब्रिलियंट ब्लू डाई के तीन रूपों का लाभ उठाते हुए, यह पत्र बताता है कि माइक्रोप्लेट की एक तस्वीर से निकाले गए रंग डेटा का उपयोग करके नमूनों में प्रोटीन को सटीक रूप से कैसे निर्धारित किया जाए। माइक्रोप्लेट में परख करने के बाद, स्मार्टफोन कैमरे का उपयोग करके एक तस्वीर ली जाती है, और आरजीबी रंग डेटा को एक मुफ्त और ओपन-सोर्स इमेज एनालिसिस सॉफ्टवेयर एप्लिकेशन का उपयोग करके तस्वीर से निकाला जाता है। फिर, प्रोटीन की अज्ञात सांद्रता वाले नमूनों की नीले से हरे रंग की तीव्रता (आरजीबी पैमाने में) के अनुपात का उपयोग मानक वक्र के आधार पर प्रोटीन सामग्री की गणना करने के लिए किया जाता है। आरजीबी रंग डेटा का उपयोग करके गणना किए गए मूल्यों और पारंपरिक अवशोषण डेटा का उपयोग करके गणना किए गए मूल्यों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा गया है।
डाउनस्ट्रीम उपयोग (जैसे, एलिसा, एंजाइम कैनेटीक्स, पश्चिमी सोख्ता, प्रोटीन शुद्धि, और मास स्पेक्ट्रोमेट्री) के बावजूद, जीवन विज्ञान प्रयोगशालाओं में सटीक विश्लेषण के लिए प्रोटीन मात्रा का ठहराव महत्वपूर्ण है। माध्यमिक रीडआउट के रूप में उनके उपयोग के अलावा (यानी, प्रोटीन के प्रति द्रव्यमान विश्लेषण के सापेक्ष स्तर की गणना करने के लिए), एक नमूने में प्रोटीन का स्तर भी वांछित आउटपुट हो सकता है। उदाहरण के लिए, खाद्य संसाधनों1 या मूत्र2 में प्रोटीन के स्तर में रुचि हो सकती है। नमूनों में प्रोटीन एकाग्रता को मापने के लिए कई तरीके उपलब्ध हैं3, प्रत्यक्ष यूवी अवशोषण रीडिंग4, प्रोटीन-कॉपर केलेशन 5,6, प्रोटीन-डाई बाध्यकारी वर्णमिति परख7, और प्रोटीन-डाई बाध्यकारी फ्लोरोसेंट परख8 सहित। प्रोटीन मात्रा की प्रासंगिकता सबसे उद्धृत साहित्य 9,10 के शीर्ष -3 में प्रोटीन माप विधियों 5,7 का वर्णन करने वाले दो पत्रों की उपस्थिति से स्पष्ट है। इस तथ्य के बावजूद कि कई लेखक गैर-प्राथमिक संदर्भों का हवाला देते हुए या कुछ भी उद्धृत नहीं करके अपने वास्तविक उद्धरण की उपेक्षा करते हैं, लोरी प्रोटीन परख और ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख का वर्णन करने वाले मूल कागजात प्रत्येक10 में > 200,000 उद्धरण देते हैं।
ब्रैडफोर्ड परख की लोकप्रियता इसकी सामर्थ्य, सादगी, गति और संवेदनशीलता से उपजी है। परख अम्लीय परिस्थितियों में प्रोटीन और डाई कूमासी ब्रिलियंट ब्लू जी के बीच बातचीत पर आधारित है। परख (यानी, कम पीएच) की शर्तों के तहत, डाई तीन रूपों में मौजूद है: 470 एनएम पर λmax के साथ एक लाल धनायनित रूप; 650 एनएम पर λmax के साथ एक हरा तटस्थ रूप; और 590 एनएम11,12 (चित्रा 1) पर λmax के साथ एक नीला आयनिक रूप। प्रोटीन की अनुपस्थिति में धनायनित रूप प्रबल होता है। जैसे ही प्रोटीन डाई के साथ बातचीत करते हैं, वे नीले आयनिक रूप को स्थिर करते हैं, जिससे समाधान के रंग में भूरे से नीले रंग में ध्यान देने योग्य परिवर्तन होता है। आमतौर पर, डाई के नीले रूप की एकाग्रता में परिवर्तन स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से निर्धारित किया जाता है, जिसका अवशोषण 590-595 एनएम पर परख में प्रोटीन की मात्रा के लिए आनुपातिक होता है।
चित्रा 1: ब्रैडफोर्ड परख की शर्तों के तहत कूमासी शानदार नीले जी अवशोषण स्पेक्ट्रा। तीन मुख्य चोटियों को तीर के साथ चिह्नित किया जाता है जो डाई के लाल (470 एनएम), हरे (650 एनएम), और नीले (590 एनएम) रूपों के λमैक्स को दर्शाता है। स्पेक्ट्रा प्रोटीन (पीली रेखा) की अनुपस्थिति में और गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन के 3 μg (ग्रे लाइन) और 10 μg (नीली रेखा) की उपस्थिति में दर्ज किए गए थे। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
ब्रैडफोर्ड परख के व्यापक उपयोग कई सीमाओं की पहचान के लिए नेतृत्व किया है (जैसे, विभिन्न प्रोटीन11 के लिए चर प्रतिक्रियाओं, और लिपिड13 और डिटर्जेंट7 द्वारा हस्तक्षेप) और संशोधनों के विकास के लिए अपने प्रदर्शन में सुधार करने के लिए (जैसे, डिटर्जेंट14,15 के अलावा, क्षारीकरण14,16 और अवशोषण17 के अनुपात का उपयोग). परख में ही संशोधनों के अलावा, विश्लेषणात्मक संकेतों को पकड़ने के लिए स्मार्टफोन या कैमरों जैसे वैकल्पिक उपकरणों का उपयोग भी 18,19,20 वर्णित किया गया है। दरअसल, पोर्टेबल रासायनिक विश्लेषक के रूप में स्मार्टफोन का उपयोग करने वाले तरीकों का विकास अनुसंधान का एक सक्रिय क्षेत्र रहा है। स्मार्टफोन के उपयोग की प्रेरणा इन उपकरणों की सामर्थ्य, पोर्टेबिलिटी, उपयोग में आसानी और व्यापक उपलब्धता से उपजी है।
यह पेपर RGBradford परख20 का उपयोग करके प्रोटीन परिमाणीकरण के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, जो एक विश्लेषणात्मक उपकरण के रूप में स्मार्टफोन का उपयोग करता है। मूल RGBradford प्रकाशन20 के विपरीत, यहां, रंग निष्कर्षण प्रक्रिया को सुव्यवस्थित करने वाली एक प्रक्रिया पेश की गई है। इसमें माइक्रोप्लेट चित्र के प्रत्येक कुएं से स्वचालित रूप से रंग जानकारी निकालने के लिए स्वतंत्र रूप से उपलब्ध सॉफ़्टवेयर एप्लिकेशन का उपयोग शामिल है, जिससे महत्वपूर्ण समय और प्रयास की बचत होती है। यह एक ग्राफिक्स संपादक सॉफ्टवेयर अनुप्रयोग20 का उपयोग करके एक-एक करके प्रत्येक अच्छी तरह से मैन्युअल रूप से रंग डेटा प्राप्त करने की पिछली विधि का एक विकल्प है। अंततः, नमूनों में प्रोटीन के स्तर को स्मार्टफोन के साथ ली गई माइक्रोप्लेट की तस्वीर से निकाले गए रंग डेटा का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है।
यह पत्र आरजीब्रैडफोर्ड का वर्णन करता है, एक विधि जो ब्रैडफोर्ड प्रोटीन परख से डेटा रिकॉर्ड करने, रंग डेटा निकालने और जैविक नमूनों में प्रोटीन के स्तर को सटीक रूप से निर्धारित करने के लिए स्मार्टफोन कै?…
The authors have nothing to disclose.
इस कार्य को नेशनल काउंसिल फॉर साइंटिफिक एंड टेक्नोलॉजिकल डेवलपमेंट (CNPq, ब्राजील) [अनुदान संख्या 428048/2018-8 और 402556/2022-4] और ब्रासीलिया विश्वविद्यालय (ब्राजील) द्वारा वित्त पोषित किया गया था। लेखक इस शोध में उपयोग किए गए अपने स्मार्टफ़ोन तक पहुंच प्रदान करने के लिए डॉ. डुटर्टे नूनो कार्वाल्हो और डॉ. एवलिन सैंटोस (i3s, पोर्टो, पुर्तगाल) को धन्यवाद देते हैं।
96-well flat-bottom polystyrene microtiter plates | Jet Biofil, Guangzhou, China | TCP011096 | Any flat-bottom microplate compativle with optical reading will suffice. |
Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | A2153 | |
Coomassie Brilliant Blue G | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | B0770 | |
Ethyl alcohol | |||
iPhone 11 | Apple | MWM02BR/A | Can be substituted with other smartphone equiped with a camera |
iPhone 14 Pro | Apple | N/A | |
Phosphoric acid | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 695017 | |
Redmi Note 9 Pro | XIAOMI | N/A | |
S22 Ultra | Samsung | N/A | |
SpectraMax 384 Plus. Microplate reader. | Molecular Devices, San Jose, CA | PLUS 384 | Any microplate reader capable of reading at 450 nm and 590 nm will work. This is optional. The method was actually created to dismiss the need of a microplate reader. |