Generation of Monocyte-Derived Dendritic Cells with Differenting Sialylated Phenotypes (시알릴화 표현형이 다른 단핵구 유래 수지상 세포 생성)

세포는 서면으로 정보에 입각한 기증자 동의를 얻은 후 국립 혈액 은행인 Instituto Português do Sangue e da Transplantação(IPST)에서 제공한 자원 봉사자인 건강한 익명의 헌혈자의 담황색 코트에서 분리되었습니다(IMP.74.52.4). 혈액 사용은 인체 조직과 세포의 기증, 조달, 검사, 처리, 보존, 보관 및 분배를 위한 품질 및 안전 표준에 관한 지침 2004/23/EC에 따라 윤리 위원회(IPST 30072015)의 승인을 받았습니다(포르투갈 법률 22/2007, 6월 29일). IPST 바이오뱅크는 보존 및 항응고제인 구연산염 인산염 포도당(CPD)이 들어 있는 특정 비닐 수집 백에 혈액을 수집하여 보관하여 처리될 때까지 혈액의 무결성을 유지합니다. 생물학적 물질이 조작에 적합한지 평가하기 위해 Treponema pallidum, B형 간염 바이러스(HBV), C형 간염 바이러스(HCV) 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 혈청학적 대조를 수행하며, 모두 음성이어야 합니다. 본 연구를 위해 IPST는 조사 목적으로 버피 코트를 기증자의 수집 날짜, 혈청학적 결과, 혈액형 및 연령에 관한 정보와 함께 제공하였다32. 버피 코트는 최대 1일 동안 실온에 보관할 수 있습니다. 1. 단핵구 유래 수지상세포 획득 알림: 인간의 말초 혈액을 조작할 때 특정 보편적인 안전 예방 조치와 적절한 물질 폐기를 고려해야 한다는 점을 언급하는 것이 중요합니다. 시작하기 전에 필요한 모든 시약과 재료가 준비되어 사용할 준비가 되었는지 확인하십시오. 말초 혈액 단핵 세포의 분리인간 버피 코트를 이용하세요.참고: 버피 코트는 원심분리를 통해 백혈구에 농축된 백혈구 성분채집술32를 통해 수집된 혈액에서 파생된 부산물입니다. 모든 단계는 수직 유동 챔버 생물 안전 캐비닛(BSC)에서 수행되었습니다. 밀봉된 배출 튜브를 메스로 절단하여 버피 코트 포장을 열고 내용물을 50mL 튜브에 옮깁니다. 멸균 15mL 코니컬 튜브당 7mL의 버피 코트 샘플을 옮기고 6mL의 인산염 완충 식염수(PBS)를 추가하여 예비 세척을 수행합니다. 이 초기 세척 단계는 상당한 양의 적혈구(RBC)와 혈장에서 시료를 세척하여 시료가 밀도 그래디언트 배지를 사용한 그래디언트 분리에 최적화되도록 하기 위해 필요합니다( 재료 표 참조). 스윙 로터가 있고 브레이크를 끈 상태에서 원심분리기에서 1,100 x g 으로 실온에서 10분 동안 튜브를 원심분리합니다( 재료 표 참조). 원심분리 후 파스퇴르 피펫으로 백혈구 현탁액(혈장과 적혈구 사이의 흰색 고리)을 수집하여 새로운 멸균 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 최대 10mL의 백혈구 현탁액을 PBS로 채워 다음 분리 단계를 돕고 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 혼합합니다. 밀도 그래디언트 배지 준비(밀도: 1.077g/mL) 용액: 밀도 그래디언트 배지 3mL를 새로운 멸균 15mL 코니컬 튜브에 넣고 실온으로 예열합니다. 밀도 그래디언트 배지(5:3)가 들어 있는 원추형 튜브에 희석된 백혈구 현탁액(1.1.5단계에서) 5mL를 추가하여 밀도 그래디언트 분리를 수행합니다. 밀도 구배 매질을 방해하지 않도록 튜브 벽을 사용하여 샘플을 한 방울씩 천천히 추가합니다. 그래디언트 분리: 스윙 로터가 있고 브레이크를 끈 상태에서 원심분리기에서 1,100 x g 으로 실온에서 30분 동안 밀도 그래디언트 배지 현탁액을 원심분리합니다. 원심분리 후 원심분리기에서 원추형 튜브를 조심스럽게 제거합니다. 이 단계가 끝나면 아래부터 시작하여 적색 층(RBC 및 과립구), 밀도 구배 배지, 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 얇고 창백한 층 및 혈장을 포함하여 잘 정의된 다양한 층을 볼 수 있습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 PBMC의 얇은 층을 수집하고, 아래의 밀도 구배 매질이나 위의 플라즈마를 너무 많이 사용하지 마십시오. PBMC 검체를 새 50mL 코니컬 튜브에 넣고 PBS로 최대 25mL를 채운 다음 위아래로 부드럽게 피펫팅하여 검체를 혼합합니다. 샘플을 실온에서 600 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리하여 잔류 세포와 파편을 씻어내고 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다.알림: 적혈구 오염이 너무 많으면 세포 펠릿 또는 버피 코트가 완전히 분리되지 않거나 붉게 보일 때 관찰할 수 있으므로 나머지 적혈구를 용해하는 것이 좋습니다. 이 경우 5mL의 RBC 용해 완충액( 재료 표 참조)을 넣고 잘 혼합한 후 5분 동안 배양합니다. PBS로 최대 40mL를 채우고 샘플을 실온에서 900 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리한 다음 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다. PBS로 샘플을 10mL까지 채우고 부분 표본을 사용하여 세포를 계산합니다. 혈소판을 제거하려면 실온에서 400 x g (일반 브레이크)으로 5분 동안 원심분리하고 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다.알림: 혈소판이 많은 경우 실온에서 10분 동안 200 x g (일반 브레이크)으로 원심분리기를 두 번 합니다. 혈소판은 세포를 계수하는 동안 샘플을 시각화하여 식별합니다. 면역자기 분리에 의한 단핵구 분리PBS에 0.5% 소 혈청 알부민(BSA)과 2mM 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)을 보충하여 마이크로비즈 완충액을 준비합니다. 여과(0.2μm)로 용액을 멸균하고 완충액을 냉장(2-8°C)으로 유지합니다. MACS(magnetic-activated cell sorting)를 통해 단핵구 CD14+ 분리를 수행합니다.자동 세포 계수기(단계 1.4.1)를 사용하여 세포 계수를 수행한 후 필요한 마이크로비즈 완충액 및 CD14 면역자성 비드( 재료 표 참조)의 적절한 부피를 계산합니다. 이러한 용액을 얼음 위에 보관하십시오. 1 x 107 세포당 80μL의 마이크로비즈 완충액을 추가하고 1 x 107 세포당 20μL의 CD14 비드를 추가합니다. 세포 펠릿을 이전에 측정된 부피에 재현탁시키고 4°C(2-8°C)에서 15분 동안 배양합니다.참고: PBMC 샘플의 단핵구 수준 확인이 필요한 경우 염색 항체(예: CD14 [Monoclonal TÜK4])를 사용하여 유세포 분석을 수행합니다. 유세포 분석에 대한 자세한 내용은 3.2단계를 따르십시오. 1 x 107 세포당 1-2mL의 마이크로비즈 완충액을 추가하고 실온에서 600 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리하여 결합되지 않은 비드를 제거한 다음 튜브를 조심스럽게 뒤집어 상층액을 버립니다. LS 컬럼을 준비합니다. LS 컬럼은 자석 상에 놓일 때 자기적으로 표지된 세포(33)의 포지티브하고 부드러운 머무름을 허용하는 강자성 구체를 포함한다. 사용 직전에 LS 컬럼( 재료 표 참조)을 자석에 놓고 완전히 건조되지 않고 3mL의 마이크로비즈 완충액으로 헹구고 즉시 다음 단계로 진행합니다.알림: 수율 저하를 방지하기 위해 절차 중에 컬럼이 마르지 않도록 하십시오. 세포 펠릿을 1 x 108 세포당 500μL의 마이크로비즈 완충액에 재현탁시킵니다. 세포 수가 4 x 108보다 높으면 40μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포 응집을 방지하십시오. 컬럼 주입구에 세포 현탁액을 추가하고, 컬럼 출구 아래에 15mL 코니컬 튜브를 놓아 음성 세포 분획을 수집하고, 3mL의 마이크로비즈 완충액으로 컬럼을 세 번 세척합니다. 음성 분획은 CD14 비드로 수집되지 않은 세포(즉, CD14− 세포)로 구성됩니다. 최종 세척 후 자석에서 컬럼을 제거하고 멸균된 15mL 코니컬 튜브에 놓고 5mL의 마이크로비즈 완충액을 컬럼 주입구에 피펫팅한 다음 즉시 주사기 플런저를 컬럼 주입구에 삽입하고 밀어 표적 세포를 분주합니다. 1.4.1단계에서 설명한 대로 자기적으로 표지된 세포(CD14+ 세포)를 수집하고 부분 표본을 사용하여 세포를 계수합니다. 세포 분획, CD14- 및 CD14+ 세포를 실온에서 600 x g (일반 브레이크)에서 10분 동안 원심분리합니다. 상층액을 폐기하고, 다음 단계를 위해 CD14+ 분획을 보관하고, 필요한 경우 공동 배양 분석과 같은 향후 분석을 위해 CD14− 분획을 보관합니다. 필요한 경우 CD14− 분획의 세포를 -80°C에서 RPMI-1640 20% FBS 및 10% DMSO로 동결 보존할 수 있습니다. 수지상세포로의 단핵구 분화RPMI-1640 기본 배지(11.1mM 포도당 포함)에 소 태아 혈청(FBS) 10%, L-글루타민 2mM 1%, 비필수 아미노산(NEAA) 1%, 피루브산 나트륨 1%, 페니실린/스트렙토마이신 1%를 보충하여 완전한 RPMI-1640 배지를 준비합니다( 재료 표 참조). 5~6일 동안 발생하는 mo-DC로 단핵구 분화를 수행합니다.얻어진 CD14+ 세포의 수에 필요한 배지의 부피를 계산하고 다음 실험 설정에 따라 세포를 도장합니다.참고: 이 프로토콜에서는 세포 사멸 및 측정 오류를 고려하기 위해 세포를 1.3 x 106 cells/mL의 농도로 도말하고, 배지는 1,000U/mL의 GM-CSF와 750U/mL의 IL-4( 재료 표 참조)를 완전한 배지에 첨가하고 완전히 혼합하여 제조되었습니다. CD14+ 세포에 적절한 양의 배지를 추가하고 파스퇴르 피펫으로 위아래로 피펫팅하여 재현탁합니다. 세포 현탁액을 24웰 플레이트(웰당: 1.3 x 106 cells/mL)에 패팅하고 37°C의 배양 인큐베이터에서 5%CO2로 배양합니다. 배양 배지를 교체하고 2-3일마다 신선한 사이토카인을 보충합니다(일반적으로 분화 과정당 한 번). 이를 수행하려면 세포를 방해하지 않고 배양 배지의 절반을 조심스럽게 제거합니다. 앞서 1.3.2.1 단계의 주석에서 설명한 바와 같이 적절한 농도의 사이토카인과 동일한 양의 신선한 배지를 첨가하고 나머지 분화 기간 동안 배양합니다.참고: DC는 단핵구와 분화할 때 느슨하게 부착된 세포입니다. 완전히 분화된 미성숙 mo-DC는 방추 모양, 자유 부유 및 느슨하게 부착된 세포입니다. 세포는 또한 로제트를 형성할 수 있는데, 특히 성숙할 때34. 분화 후 세포를 수집하려면 마이크로피펫을 사용하여 전체 세포 현탁액을 멸균 원뿔형 튜브로 옮기고 PBS로 플레이트의 웰을 두 번 세척하고 바닥을 가볍게 두드립니다(그림 1A).참고: 부착성이 높은 세포는 대식세포일 수 있으므로 수집하지 마십시오. 부적절한 세포 성숙 또는 활성화를 방지하려면 세포를 각별히 주의하여 다루어야 합니다. 세포를 실온에서 180 x g (일반 브레이크)으로 10분 동안 원심분리하여 잔류물이나 죽은 세포를 제거하고 실험 설정에 적합한 배지/완충액에 재현탁합니다. mo-DC의 성숙을 수행합니다.mo-DC의 성숙이 필요한 경우, 기존에 사용했던 세포 농도예(1.3 x 106 cells/mL)를 고려하여 웰 플레이트 또는 플라스크를 사용하고, IL-1β(10 ng/mL), IL-6(1,000 U/mL), 프로스타글란딘 E2(PGE2; 1 μg/mL)를 포함하는 사이토카인 칵테일을 배지에 보충하여 사이토카인 칵테일을 투여하고, 및 종양 괴사 인자 α(TNF-α; 10ng/mL)( 재료 표 참조). 37 ° C에서 5 % CO2 로 24 시간 또는 48 시간 동안 세포를 배양합니다. 세포 계수 및 생존력세포 계수 및 트리판 블루 염색을 수행합니다.세포 수와 세포 현탁액의 생존력을 측정하려면 세포 현탁액에서 10μL의 분취액을 채취하여 10μL의 트리판 블루(1:1 희석)와 혼합합니다. 이전 혼합물 10μL를 취하고 자동 셀 카운터를 사용하여 제조업체의 지침에 따라 셀 수를 계산합니다.알림: 세포 농도가 너무 높으면 부분 표본을 희석하고 세포 계수 후 계산에서 희석 계수를 고려하십시오. 실험 설정을 위해 세포 수와 매체/완충액을 조정합니다. 세포 생존율 및 세포사멸 결정30.참고: 이 작업에서는 시알리다아제 처리(섹션 2)에 이어 생존도 분석을 수행했습니다.mo-DC를 5μg/mL 7-aminoactinomycin D(7-AAD) 및 annexin V로 염색하고 제조업체의 지침에 따라 세포사멸을 결정합니다( 재료 표 참조). 유세포 분석29,30을 사용하여 결과를 분석합니다. 2. sialidase를 가진 세포의 처리 참고: mo-DC로 분화한 후 6일째에 세포는 시알리다제 처리 분석을 위한 준비가 됩니다. 원하는 실험 설정을 고려하여 1.3 x 10 6 세포/웰이 있는 24웰 플레이트의 10웰에서 ~10 x 106 mo-DC를 수집하여 새로운 멸균 15mL 코니컬 튜브로 옮깁니다.참고: 일부 셀 손실을 가정합니다. 전형적으로, 이 단계에서 발견되는 농도는 1.3 x 106 cells/mL인데, 이는 mo-DC와 그 전구체가 증식하지 않고 mo-DC로 분화하는 동안 20%의 생존력 손실을 경험하기 때문입니다. 실온에서 5 x g (일반 브레이크)에서 7-300분 동안 원심분리하고 상층액을 폐기하여 죽은 세포와 부스러기를 제거합니다. RPMI-1640 배지 10mL(포도당 11.1mM 함유)를 넣고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리한 후 상층액을 버리고 RPMI-1640 2mL를 넣고 잘 섞습니다. RPMI-1640에 1mL의 세포를 새로운 멸균 마이크로튜브(#1 및 #2)에 넣습니다. 각 마이크로튜브에는 약 5 x 106 개의 세포가 포함됩니다. 마이크로튜브 #1에 클로스트리듐 퍼프린젠스(Clostridium perfringens)에서 추출한 시알리다아제 500mU를 첨가합니다( 재료 표 참조). 마이크로튜브 #2에 음성 대조군인 모의 처리된 시알리다아제를 추가하여 관찰된 효과가 시알산 제거와 직접적인 관련이 있고 인공물에 의한 것이 아닌지 확인합니다. 모의 처리된 시알리다아제는 100°C에서 20분 동안 효소를 끓여서 얻어지는 열-불활성화 시알리다아제이다. 37°C에서 60분간 배양합니다. 배양 후 세포를 동일한 숫자 #1 및 #2를 가진 새로운 멸균 15mL 코니컬 튜브에 넣습니다. 효소 반응을 중지하기 위해 약 4mL의 완전한 RPMI-1640 배지(10% FBS 포함)를 두 튜브에 추가합니다. 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 각 튜브에 5mL의 완전한 RPMI-1640 배지를 추가하고 웰당 1mL의 세포를 플레이트에 담습니다. 3. 시알산 프로파일의 결정 렉틴 염색셀을 수집하여 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 5분 동안 세척합니다. 세포를 RPMI-1640 + 10% FBS에 재현탁시키고 세포(100,000/100μL)를 마이크로튜브에 분배합니다. 각 렉틴에 대해 0.01mg/mL의 농도를 사용하여 10% FBS로 RPMI-1640에서 유세포 분석을 위한 염색을 수행합니다: Sambucus nigra (SNA) 렉틴, 땅콩 응집체(PNA) 렉틴 및 Maackia amurensis ( MAA) 렉틴(재료 표 참조). 4 °C에서 30분간 배양합니다. 10% FBS 또는 10% BSA를 함유한 PBS 1mL로 세포를 세척하고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리합니다. 비오틴화된 렉틴으로 염색된 세포에 0.0005mg/mL streptavidin-PE( 재료 표 참조)를 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 배양합니다. PBS 1mL로 세포를 세척하고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 4분 동안 원심분리합니다. 상층액을 버리고 각 튜브에 2% 파라포름알데히드(PFA 2%) 300μL를 추가합니다. 튜브를 빛으로부터 보호하고, 필요한 경우 데이터를 수집할 때까지 4°C에서 보관합니다. 샘플 준비 후 1주일 이내에 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 수집합니다29,30. 유세포 분석PBS 1mL에 세포를 재현탁시키고 즉각적인 데이터 수집을 위해 유세포 분석기로 샘플을 획득합니다. 지연된 데이터 수집의 경우 2% PFA의 300μL에 재현탁하고 1주일 이내에 데이터를 수집합니다. 컨포칼 레이저 스캐닝 현미경12mm 직경의 폴리리신 코팅된 유리 커버슬립에 세포를 도금하고 실온에서 5분 동안 배양합니다. 커버슬립을 실온에서 100 x g (일반 브레이크)에서 1분 동안 원심분리하여 세포 접착을 촉진합니다. PBS에서 30% BSA로 세척하기 전에 4% PFA로 실온에서 1분 동안 고정합니다. FITC 복합 SNA 렉틴(0.01mg/mL)을 사용하여 세포 표면의 α2,6 결합 시알산을 염색합니다( 재료 표 참조). 컨포칼 현미경으로 이미지를 획득합니다( 재료 표 참조). Z-stack 처리 후 대표적인 컨포칼 단면 이미지를 선택합니다. 보정된 총 세포 형광(CTCF)을 사용하여 염색 강도를 분석적으로 정량화합니다.참고: CTCF = 통합 밀도 − (선택한 셀의 면적 × 배경 판독값의 평균 형광)29. 4. mo-DC의 성숙 프로파일링 항체 염색 및 유세포 분석항체 염색을 수행하기 위해 관심 세포의 새로운 샘플을 수집합니다. 세포를 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 5분 동안 세척하고 세포를 마이크로튜브에 분배합니다(튜브당 100,000개 세포). 원하는 항체(ab), MHI-I, MHC-II, CD80 및 CD86을 사용하여 유세포 분석을 위한 염색을 수행합니다( 재료 표 참조). 어두운 어두운 곳에서 실온에서 15분 동안 형광 복합 ab를 배양합니다. 1mL PBS로 셀을 세척하고 실온에서 300 x g(일반 브레이크)에서 5분 동안 원심분리합니다.참고: 라벨이 없는 ab를 사용하는 경우 형광 복합 2차 ab를 추가하고 제조업체의 지침에 따라 어두운 곳에서 15분 동안 배양합니다. PBS 1mL로 세포를 세척하고 실온에서 300 x g (일반 브레이크)에서 5분 동안 원심분리합니다. 모든 마이크로튜브에 최대 100μL의 PBS를 추가하고, 2% 파라포름알데히드(PFA 2%)의 300μL에 셀을 재현탁하고, 데이터를 수집할 때까지 튜브를 4°C의 어두운 곳에 보관합니다. 유세포 분석기를 사용하여 데이터를 수집합니다.참고: 염색 및 고정 후 샘플은 즉시 또는 1주일 이내에 유세포 분석으로 얻을 수 있습니다. 이 경우 튜브를 어두운 곳에서 4°C로 보관하십시오. 5. 효소 결합 면역 흡착 분석(ELISA) 참고: 이 작업에서 IFN-γ 생산은 제조업체의 지침에 따라 ELISA 분석을 사용하여 측정되었습니다( 재료 표 참조). 코팅 완충액에 플레이트를 코팅하기 위해 포획 항체(1:100, PBS의 포획 항체)를 희석하고 이 작업 용액 100μL를 각 웰로 옮기고 실온에서 밤새 배양합니다. 포획 항체는 완전히 폐기하십시오. 차단 완충액(예: PBS + 2% BSA + 0.05% Tween20)을 추가하고 차단 완충액을 제거하기 전에 실온에서 1시간 동안 배양합니다. 표준물질과 샘플을 각각의 혼합물 및 희석액과 함께 추가하고 실온에서 2시간 동안 배양합니다. 세척 버퍼로 5회 세탁하십시오. 비오틴화 검출기 항체를 넣고 실온에서 2시간 동안 배양한 후 5회 세척합니다. poly-HRP-streptavidin-HS를 첨가하고 실온에서 30분 동안 배양한 후 세척 완충액으로 5회 세척합니다. TMB 기질( 재료 표 참조)을 추가하고 사용 중인 테스트 시스템을 고려하여 실온에서 최대 60분 동안 배양합니다. 세척 버퍼로 5회 세탁하십시오. 450nm의 마이크로플레이트 리더에서 샘플을 판독합니다.