Farklı Sialillenmiş Fenotiplere Sahip Monosit Kaynaklı Dendritik Hücrelerin Üretimi

Hücreler, yazılı ve bilgilendirilmiş donör onayı alındıktan sonra, ulusal kan bankası Instituto Português do Sangue e da Transplantação (IPST) tarafından sağlanan gönüllüler olan sağlıklı anonim kan bağışçılarının buffy paltolarından izole edildi (IMP.74.52.4). Kan kullanımı, insan doku ve hücrelerinin bağışlanması, tedariki, test edilmesi, işlenmesi, korunması, depolanması ve dağıtımı için kalite ve güvenlik standartlarına ilişkin 2004/23/EC sayılı direktife göre etik kurul (IPST 30072015) tarafından onaylanmıştır (Portekiz Yasası 22/2007, 29 Haziran). IPST biyobankası, işlenene kadar kanın bütünlüğünü korumak için kanı koruyucu ve pıhtılaşma önleyici bir çözelti olan sitrat fosfat dekstroz (CPD) içeren özel bir plastik toplama torbasında toplar ve saklar. Biyolojik materyalin manipülasyon için uygun olup olmadığını değerlendirmek için, Treponema pallidum, hepatit B virüsü (HBV), hepatit C virüsü (HCV) ve insan immün yetmezlik virüsü (HIV) için serolojik kontrol yapılır ve bunların hepsinin negatif olması gerekir. Bu çalışma için, buffy ceket IPST tarafından araştırma amacıyla sağlanmış, toplanma tarihi, serolojik sonuçlar, kan grubu ve donörünyaşı ile ilgili bilgiler 32. Buffy ceket oda sıcaklığında en fazla 1 gün kalabilir. 1. Monosit kaynaklı dendritik hücrelerin elde edilmesi NOT: İnsan periferik kanı manipüle edilirken, belirli evrensel güvenlik önlemlerinin ve uygun malzeme imhasının dikkate alınması gerektiğini belirtmek önemlidir. Başlamadan önce, gerekli tüm reaktiflerin ve malzemelerin hazırlandığını ve kullanıma hazır olduğunu onaylayın. Periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonuİnsan buffy ceketine erişin.NOT: Buffy coat, santrifüj yoluyla beyaz kan hücrelerinde zenginleştirilen lökoferez32 yoluyla toplanan kandan elde edilen bir yan üründür. Tüm adımlar dikey akış odalı bir biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirildi. Mühürlü çıkış borusunu bir neşter ile keserek buffy coat ambalajını açın ve içindekileri 50 mL’lik bir tüpe aktarın. Steril 15 mL’lik konik tüp başına 7 mL buffy coat numunesi aktarın ve bir ön yıkama gerçekleştirmek için 6 mL fosfat tamponlu salin solüsyonu (PBS) ekleyin. Bu ilk yıkama adımı, numuneyi önemli miktarda kırmızı kan hücresinden (RBC) ve plazmadan temizlemek için gereklidir, böylece numune bir yoğunluk gradyan ortamı ile gradyan ayırma için optimize edilir (bkz. Malzeme Tablosu). Tüpü oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 1.100 x g’da döner rotorlu ve frenli bir santrifüjde santrifüjleyin ( Malzeme Tablosuna bakın). Santrifüjlemeden sonra, lökosit süspansiyonunu (plazma ve eritrositler arasındaki beyaz halka) bir Pasteur pipeti ile toplayın ve yeni bir steril 15 mL konik tüpe aktarın. Bir sonraki ayırma adımına yardımcı olmak için lökosit süspansiyonunu 10 mL’ye kadar PBS ile doldurun ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Yoğunluk gradyan ortamını hazırlayın (yoğunluk: 1.077 g / mL) çözelti: 3 mL yoğunluk gradyan ortamını yeni bir steril 15 mL konik tüpe yerleştirin ve oda sıcaklığına ısınmasına izin verin. Yoğunluk gradyan ayrımını gerçekleştirmek için yoğunluk gradyan ortamını (5:3) içeren konik tüpe 5 mL seyreltilmiş lökosit süspansiyonu (adım 1.1.5’ten itibaren) ekleyin. Yoğunluk gradyan ortamını bozmamak için tüp duvarlarını kullanarak numuneyi yavaşça, damla damla ekleyin. Gradyan ayrımı: Yoğunluk gradyanlı orta süspansiyonu, döner rotorlu ve fren kapalıyken bir santrifüjde 30 x g’de 1,100 dakika boyunca oda sıcaklığında santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, konik tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Bu adımdan sonra, aşağıdan başlayarak aşağıdakiler de dahil olmak üzere bir dizi iyi tanımlanmış katman görülebilir: kırmızı bir katman (RBC’ler ve granülositler), yoğunluk gradyan ortamı, periferik kan mononükleer hücrelerinin (PBMC) ince bir soluk tabakası ve plazma. Bir Pasteur pipeti kullanarak ince PBMC tabakasını toplayın ve aşağıdaki yoğunluk gradyan ortamını veya yukarıda çok fazla plazma almaktan kaçının. PBMC örneğini 50 mL’lik yeni bir konik tüpe yerleştirin, PBS ile 25 mL’ye kadar doldurun ve örneği hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek karıştırın. Kalan hücreleri ve kalıntıları yıkamak için numuneleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g’da (normal fren) santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın.NOT: Çok fazla kırmızı kan hücresi kontaminasyonu varsa, ki bu hücre peleti veya buffy kılıfı tamamen ayrılmadığında veya kırmızımsı göründüğünde gözlemlenebilir, kalan eritrositlerin parçalanması önerilir. Bu durumda, 5 mL RBC lizis tamponu ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakın), iyice karıştırın ve 5 dakika inkübe edin. PBS ile 40 mL’ye kadar doldurun, numuneleri oda sıcaklığında 900 x g’da (normal fren) 10 dakika santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın. Numuneyi PBS ile 10 mL’ye kadar doldurun ve hücreleri saymak için bir alikot alın. Trombositleri çıkarmak için, oda sıcaklığında 400 x g’da (normal fren) 5 dakika santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın.NOT: Önemli sayıda trombosit olması durumunda, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 200 x g’da (normal fren) iki kez santrifüjleyin. Hücreler sayılırken numune görselleştirilerek trombositler tanımlanır. İmmünomanyetik ayırma ile monosit izolasyonuPBS’yi %0.5 sığır serum albümini (BSA) ve 2 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile destekleyerek mikro boncuk tamponunu hazırlayın. Çözeltiyi süzülerek (0,2 μm) sterilize edin ve tamponu buzdolabında (2-8 °C) saklayın. Manyetik ile aktive edilen hücre sıralaması (MACS) ile monosit CD14+ izolasyonu gerçekleştirin.Otomatik bir hücre sayacı kullanarak hücre sayımından sonra (adım 1.4.1), gerekli olan uygun mikroboncuk tamponu ve CD14 immünomanyetik boncuk hacmini hesaplayın (Malzeme Tablosuna bakın). Bu çözeltilerin buz üzerinde tutulduğundan emin olun. 1 x 107 hücre başına 80 μL mikro boncuk tamponu ve 1 x 107 hücre başına 20 μL CD14 boncuk ekleyin. Hücre peletini önceden belirlenen hacimlerde yeniden süspanse edin ve 4 °C’de (2-8 °C) 15 dakika inkübe edin.NOT: PBMC örneklerinde monosit seviyelerinin doğrulanması gerekiyorsa, boyama antikorları (örneğin, CD14 [Monoklonal TÜK4]) kullanarak bir akış sitometrik analizi yapın. Akış sitometrik analiziyle ilgili ayrıntılar için adım 3.2’yi izleyin. 1 x 107 hücre başına 1-2 mL mikro boncuk tamponu ekleyin, bağlanmamış boncukları çıkarmak için oda sıcaklığında 600 x g’da (normal fren) 10 dakika santrifüjleyin ve tüpü dikkatlice ters çevirerek süpernatanı atın. LS sütununu hazırlayın. LS kolonları, bir mıknatıs üzerine yerleştirildiğinde, manyetik olarak etiketlenmiş hücrelerin pozitif, nazik tutulmasına izin veren ferromanyetik küreler içerir33. Kullanmadan hemen önce, mıknatısın üzerine bir LS sütunu ( Malzeme Tablosuna bakın) yerleştirin, tamamen kurumadan 3 mL mikro boncuk tamponu ile durulayın ve hemen bir sonraki adıma geçin.NOT: Verimden ödün vermemek için işlem sırasında kolonun kurumasına asla izin vermeyin. Hücre peletini 1 x 108 hücre başına 500 μL mikro boncuk tamponunda yeniden süspanse edin. Hücre sayısı 4 x 108’den yüksekse, hücre toplanmasını önlemek için 40 μm’lik bir hücre süzgeci kullanın. Hücre süspansiyonunu kolon girişine ekleyin, negatif hücre fraksiyonunu toplamak için kolon çıkışının altına 15 mL’lik konik bir tüp yerleştirin ve kolonu 3 mL mikroboncuk tamponu ile üç kez yıkayın. Negatif fraksiyon, CD14 boncukları ile toplanmayan hücreleri (yani CD14− hücreleri) içerir. Son yıkamadan sonra, kolonu mıknatıstan çıkarın, steril bir 15 mL konik tüpe yerleştirin, kolon girişine 5 mL mikro boncuk tamponu pipetleyin ve şırınga pistonunu hemen kolon girişine yerleştirin ve hedef hücreleri dağıtmak için itin. Manyetik olarak etiketlenmiş hücreleri (CD14+ hücreleri) toplayın ve adım 1.4.1’de açıklandığı gibi hücreleri saymak için bir alikot alın. Her iki hücre fraksiyonunu, CD14− ve CD14+ hücrelerini, oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 600 x g’da (normal fren) santrifüjleyin. Süpernatanı atın, sonraki adımlar için CD14 + fraksiyonunu saklayın ve gerekirse ko-kültür tahlilleri gibi gelecekteki tahliller için CD14− fraksiyonunu saklayın. Gerekirse, CD14− fraksiyonundan gelen hücreler −80 °C’de RPMI-1640 FBS ve DMSO’da dondurularak saklanabilir. Dendritik hücrelere monosit farklılaşmasıRPMI-1640 baz ortamını (11.1 mM glikoz içeren)% 10 fetal sığır serumu (FBS),% 1 2 mM L-glutamin,% 1 esansiyel olmayan amino asitler (NEAA),% 1 sodyum piruvat ve% 1 100 μg / mL penisilin / streptomisin ile destekleyerek tam RPMI-1640 ortamı hazırlayın (Malzeme Tablosuna bakınız). ~5-6 gün içinde meydana gelen mo-DC’lere monosit farklılaşması gerçekleştirin.Elde edilen CD14+ hücre sayısı için gerekli ortam hacmini hesaplayın ve hücreleri aşağıdaki deney düzeneğine göre plakalayın.NOT: Bu protokolde, hücre ölümü ve ölçüm hataları dikkate alınarak hücreler 1.3 x 106 hücre/mL konsantrasyonda kaplandı ve besiyeri, 1.000 U/mL GM-CSF ve 750 U/mL IL-4 (Malzeme Tablosuna bakınız) eklenerek hazırlandı ve iyice karıştırıldı. CD14+ hücrelerine uygun hacimde ortam ekleyin ve bir Pasteur pipeti ile yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 24 oyuklu plakalara (oyuk başına: 1.3 x 106 hücre / mL) yerleştirin ve bir kültür inkübatöründe 37 ° C’de% 5 CO2 ile inkübe edin. Kültür ortamını değiştirin ve her 2-3 günde bir taze sitokinlerle destekleyin (genellikle farklılaşma işlemi başına bir kez). Bunu gerçekleştirmek için, hücreleri rahatsız etmeden kültür ortamının yarısını dikkatlice çıkarın. Daha önce adım 1.3.2.1’deki notta açıklandığı gibi, uygun sitokin konsantrasyonuna sahip aynı miktarda taze ortam ekleyin ve kalan farklılaşma süresi boyunca inkübe edin.NOT: DC’ler, monositlerden farklılaşırken, gevşek bir şekilde yapışan hücrelerdir. Tamamen farklılaşmış olgunlaşmamış mo-DC’ler, iğ şeklinde, serbest yüzen ve gevşek bir şekilde yapışan hücrelerdir. Hücreler, özellikle olgunlaştığında rozetler de oluşturabilir34. Farklılaşmadan sonra hücreleri toplamak için, tüm hücre süspansiyonunu steril bir konik tüpe aktarmak için bir mikropipet kullanın ve plakanın kuyucuklarını PBS ile iki kez yıkayın, tabana hafifçe vurun (Şekil 1A).NOT: Muhtemelen makrofajlar olduğu için yoğun bir şekilde yapışan hücreleri toplamaktan kaçının. Yanlış hücre olgunlaşmasını veya aktivasyonunu önlemek için, hücrelerin çok dikkatli kullanıldığından emin olun. Herhangi bir kalıntı veya ölü hücreyi çıkarmak için hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 180 x g’de (normal fren) santrifüjleyin ve deney düzeneği için uygun ortamda/tamponda yeniden süspanse edin. Mo-DC’lerin olgunlaşmasını gerçekleştirin.Mo-DC’lerin olgunlaşmasının gerekli olması durumunda, daha önce kullanılan hücre konsantrasyonu örneğini (1.3 x 10 6 hücre/mL) dikkate alarak bir kuyu plakası veya şişesi kullanın ve ortamı IL-1β (10 ng/mL),IL-6 (1.000 U/mL), prostaglandin E2 (PGE2; 1 μg/mL) içeren bir sitokin kokteyli ile destekleyerek bir sitokin kokteyli uygulayın, ve tümör nekroz faktörü-α (TNF-α; 10 ng / mL) (Malzeme Tablosuna bakınız). Hücreleri 37 ° C’de% 5 CO2 ile 24 saat veya 48 saat inkübe edin. Hücre sayımı ve canlılığıHücre sayımı ve tripan mavisi boyama gerçekleştirin.Hücre sayısını ve bir hücre süspansiyonunun canlılığını belirlemek için, hücre süspansiyonundan 10 μL’lik bir alikot alın ve 10 μL tripan mavisi (1: 1 seyreltme) ile karıştırın. Önceki karışımdan 10 μL alın ve üreticinin talimatlarına göre hücre sayısını saymak için otomatik hücre sayacını kullanın.NOT: Hücrelerin konsantrasyonu çok yüksekse, alikotu seyreltin ve hücre sayımından sonra hesaplamalarda seyreltme faktörünü dikkate alın. Deney düzeneği için hücre numarasını ve ortamı/tamponu ayarlayın. Hücre canlılığını ve apoptozu belirleyin30.NOT: Bu çalışmada, sialidaz tedavisini takiben (bölüm 2), canlılık testi yapılmıştır.Mo-DC’leri 5 μg / mL 7-aminoaktinomisin D (7-AAD) ve ekin V ile boyayın ve üreticinin talimatlarına göre apoptozu belirleyin (Malzeme Tablosuna bakın). Sonuçları akış sitometrisi29,30 kullanarak analiz edin. 2. Hücrelerin sialidaz ile tedavisi NOT: Mo-DC’lere farklılaştıktan sonra, altıncı günde, hücreler sialidaz tedavi testi için hazırdır. İstenen deney düzeneğini göz önünde bulundurarak, 1.3 x 106 hücreli/oyuklu 24 oyuklu plakanın 10 kuyusundan ~10 x 106 mo-DC toplayın ve bunları yeni bir steril 15 mL konik tüpe aktarın.NOT: Bir miktar hücre kaybı olduğunu varsayın; tipik olarak, bu aşamada, bulunan konsantrasyon 1.3 x 106 hücre/mL’dir, çünkü mo-DC’ler ve öncülleri çoğalmaz ve mo-DC’lere farklılaşma sırasında canlılık kaybı yaşar. Oda sıcaklığında 300 x g’da (normal fren) 5-7 dakika santrifüjleyin ve ölü hücreleri ve kalıntıları temizlemek için süpernatanı atın. 10 mL RPMI-1640 ortamı (11.1 mM glikoz içerir) ekleyin, oda sıcaklığında 300 x g’da (normal fren) 4 dakika santrifüjleyin, süpernatanı atın, 2 mL RPMI-1640 ekleyin ve iyice karıştırın. RPMI-1640’ta 1 mL hücreyi yeni steril mikrotüplere, #1 ve #2’ye yerleştirin; Her mikrotüp yaklaşık 5 x 106 hücre içerecektir. Mikrotüp #1’e, Clostridium perfringens’ten 500 mU sialidaz ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Mikrotüp #2’ye, gözlenen etkilerin doğrudan sialik asit giderimi ile ilişkili olup olmadığını ve artefaktlardan kaynaklanıp kaynaklanmadığını doğrulamak için negatif bir kontrol olan sahte muamele edilmiş sialidaz ekleyin. Sahte muamele edilmiş sialidaz, enzimin 100 °C’de 20 dakika kaynatılmasıyla elde edilen ısıyla inaktive edilmiş sialidazdır. 37 °C’de 60 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, hücreleri aynı numaralandırma, #1 ve #2 ile yeni steril 15 mL konik tüplere yerleştirin. Enzimatik reaksiyonu durdurmak için her iki tüpe yaklaşık 4 mL tam RPMI-1640 ortamı ( FBS içerir) ekleyin. Oda sıcaklığında 300 x g’da (normal fren) 4 dakika santrifüjleyin ve süpernatanı atın. Her tüpe 5 mL tam RPMI-1640 ortamı ekleyin ve oyuk başına 1 mL hücre plakalayın. 3. Sialik asit profilinin belirlenmesi Lektin boyamaHücreleri toplayın ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’da (normal fren) yıkayın. Hücreleri RPMI-1640 +% 10 FBS’de yeniden süspanse edin ve hücreleri (100.000 / 100 μL) mikrotüplere dağıtın. Her lektin için 0.01 mg / mL’lik bir konsantrasyon kullanarak% 10 FBS ile RPMI-1640’ta akış sitometrisi için boyama yapın: Sambucus nigra (SNA) lektin, fıstık aglütininin (PNA) lektin ve Maackia amurensis (MAA) lektin (Malzeme Tablosuna bakınız). 4 °C’de 30 dakika inkübe edin. Hücreleri FBS veya BSA içeren 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g’da (normal fren) 4 dakika santrifüjleyin. Biyotinile lektinlerle boyanmış hücrelere 0.0005 mg / mL streptavidin-PE ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g’da 4 dakika santrifüjleyin (normal fren). Süpernatanı atın ve her tüpe 300 μL %2 paraformaldehit (PFA %2) ekleyin. Tüpleri ışıktan koruyun ve gerekirse veri alınana kadar 4 °C’de saklayın. Numune hazırlandıktan sonraki 1 hafta içinde bir akış sitometresi kullanarak verileri elde edin 29,30. Akış sitometrisiHücreleri 1 mL PBS’de yeniden süspanse edin ve anında veri toplama için numuneyi bir akış sitometresi ile alın. Gecikmeli veri alımı için, 300 μL’de %2 PFA’da yeniden askıya alın ve verileri 1 hafta içinde alın. Konfokal lazer tarama mikroskobuHücreleri 12 mm çapında polilisin kaplı cam lameller üzerine yerleştirin ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe edin. Hücre yapışmasını desteklemek için lamelleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 100 x g’da (normal fren) santrifüjleyin. PBS’de %1 BSA ile yıkamadan önce %4 PFA ile oda sıcaklığında 30 dakika sabitleyin. Hücre yüzeylerinde α2,6’ya bağlı sialik asitleri boyamak için FITC ile konjuge SNA lektin (0.01 mg / mL) kullanın (Malzeme Tablosuna bakınız). Konfokal mikroskopta görüntüler elde edin ( Malzeme Tablosuna bakın). Z yığını işlemeden sonra, temsili konfokal kesit görüntülerini seçin. Düzeltilmiş toplam hücre floresansını (CTCF) kullanarak boyama yoğunluğunu analitik olarak ölçün.NOT: CTCF = Entegre yoğunluk − (Seçilen hücrenin alanı × Arka plan okumalarının ortalama floresansı)29. 4. mo-DC’lerin olgunlaşma profili oluşturma Antikor boyama ve akış sitometrisiAntikor boyaması yapmak için ilgilenilen hücrelerin yeni bir örneğini toplayın. Hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 x g’da (normal fren) yıkayın ve hücreleri mikrotüplere dağıtın (tüp başına 100.000 hücre). İstenen antikorları (ab), MHI-I, MHC-II, CD80 ve CD86’yı kullanarak akış sitometrisi için boyama yapın ( Malzeme Tablosuna bakınız). Floresan konjuge ab’yi karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g’da (normal fren) 5 dakika santrifüjleyin.NOT: Etiketlenmemiş ab kullanıyorsanız, floresan konjuge ikincil ab ekleyin ve üreticinin talimatlarına göre karanlıkta 15 dakika inkübe edin. Hücreleri 1 mL PBS ile yıkayın ve oda sıcaklığında 300 x g’da (normal fren) 5 dakika santrifüjleyin. Tüm mikrotüplere 100 μL’ye kadar PBS ekleyin, hücreleri 300 μL% 2 paraformaldehit (PFA% 2) içinde yeniden süspanse edin ve veri toplanana kadar tüpleri 4 ° C’de karanlıkta tutun. Bir akış sitometresi kullanarak verileri elde edin.NOT: Boyama ve fiksasyondan sonra, numuneler hemen veya 1 haftalık bir süre içinde akış sitometrisi ile alınabilir. Bu durumda tüpleri 4 °C’de karanlıkta saklayın. 5. Enzime bağlı immünosorbent testi (ELISA) NOT: Bu çalışmada, IFN-γ üretimi, üreticinin talimatları izlenerek ELISA testi kullanılarak ölçülmüştür (bkz. Malzeme Tablosu). Plakayı bir kaplama tamponunda kaplamak için, yakalama antikorunu (1:100, PBS’de yakalama antikoru) seyreltin, bu çalışma çözeltisinin 100 μL’sini her bir oyuğa aktarın ve gece boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Yakalama antikorunu tamamen atın. Engelleme tamponunu ekleyin (örneğin, PBS + %2 BSA + %0,05 Tween20) ve engelleme tamponunu çıkarmadan önce oda sıcaklığında 1 saat inkübe edin. İlgili karışım ve seyreltmelerle birlikte standardı ve numuneyi ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin. Yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Biyotinile dedektör antikorunu ekleyin ve oda sıcaklığında 2 saat inkübe edin, ardından beş yıkama yapın. Poli-HRP-streptavidin-HS ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, ardından yıkama tamponu ile beş yıkama yapın. TMB substratı ekleyin (Malzeme Tablosuna bakın) ve kullanılan test sistemini dikkate alarak oda sıcaklığında 60 dakikaya kadar inkübe edin. Yıkama tamponu ile beş kez yıkayın. Numuneleri 450 nm’de bir mikroplaka okuyucuda okuyun.