Un protocole unique et complet pour générer des cellules dendritiques dérivées de monocytes humains désialylés (mo-DCs) à partir de cellules mononucléées isolées du sang périphérique (PBMC) à l’aide d’un traitement à la sialidase est présenté. De plus, des méthodes permettant d’évaluer la caractérisation phénotypique et fonctionnelle des mo-DC et d’évaluer comment le traitement à la sialidase améliore le niveau de maturation des mo-DC sont décrites.
Les acides sialiques sont des monosaccharides chargés négativement que l’on trouve généralement aux extrémités des glycanes de surface cellulaire. En raison de leur hydrophilie et de leurs caractéristiques biophysiques, ils sont impliqués dans de nombreux processus biologiques, tels que la modulation de la réponse immunitaire, la reconnaissance des antigènes du soi et du non-soi, les interactions glucides-protéines, etc. Le contenu cellulaire de l’acide sialique est régulé par la sialidase, qui catalyse l’élimination des résidus d’acide sialique. Plusieurs études ont montré que les sialo-glycanes sont essentiels dans la surveillance immunitaire en s’engageant avec les récepteurs Siglec cis et trans-inhibiteurs sur les cellules immunitaires. De même, les points de contrôle glyco-immunitaires dans le cancer deviennent des cibles cruciales pour le développement d’immunothérapies. De plus, les cellules dendritiques (DC) sont considérées comme un composant important des immunothérapies, en particulier dans la recherche sur le cancer, en raison de leur rôle unique en tant que cellules présentatrices d’antigènes (CPA) professionnelles et de leur capacité à déclencher des réponses immunitaires adaptatives et à générer une mémoire immunologique. Néanmoins, la fonction des CD dépend de leur pleine maturation. Les DC immatures ont une fonction opposée aux DC matures et une teneur élevée en acide sialique, ce qui atténue encore leur niveau de maturation. Cela régule à la baisse la capacité des DC immatures à activer les lymphocytes T, ce qui entraîne une réponse immunitaire compromise. Par conséquent, l’élimination de l’acide sialique de la surface cellulaire des DC humains induit leur maturation, augmentant ainsi l’expression des molécules du CMH et la présentation de l’antigène. De plus, il peut restaurer l’expression des molécules co-stimulatrices et de l’IL-12, ce qui permet aux DC d’avoir une plus grande capacité à polariser les lymphocytes T vers un phénotype Th1 et à activer spécifiquement les lymphocytes T cytotoxiques pour tuer les cellules tumorales. Par conséquent, l’acide sialique est apparu comme un modulateur clé des DC et est utilisé comme nouvelle cible pour faire progresser leur utilisation thérapeutique. Cette étude fournit une approche unique pour traiter in vitro les DC dérivés de monocytes avec de la sialidase, visant à générer des populations de DC avec différents phénotypes d’acide sialique à la surface des cellules et des profils de maturation et de co-stimulation adaptés.
Les glycanes porteurs d’acide sialique (sialoglycanes) ont suscité un intérêt significatif en raison de leur rôle immunomodulateur. Le monosaccharide acide sialique, qui est le plus répandu chez l’homme sous forme d’acide N-acétylneuraminique, présente des ligands fondamentaux pour les lectines avec un rôle reconnu en immunologie, tels que les sélectines et les Siglecs. Ces lectines reconnaissent les sialoglycanes soit sur la même cellule (cis), soit sur des cellules différentes (trans) et jouent un rôle important dans les interactions hôte-pathogène et dans diverses activités cellulaires physiologiques et pathologiques 1,2,3. De plus, étant donné que l’acide sialique occupe les positions terminales des glycoconjugués de surface cellulaire, il peut dissimuler les structures sous-jacentes, inhibant ainsi le contact de cellule à cellule via des effets répulsifs non spécifiques ou en obstruant la détection par d’autres lectines4. L’activité d’une variété de sialyltransférases (qui transfèrent les acides sialiques) et de sialidases (qui clivent les liaisons de l’acide sialique) à l’intérieur de la cellule détermine la quantité d’acide sialique présente à la surface. De plus, les sialyltransférases et les sialidases solubles exprimées par l’hôte ou les agents pathogènes peuvent modifier extrinsèquement la quantité d’acide sialique à la surface de la cellule 5,6.
La sialylation aberrante est une caractéristique de plusieurs conditions pathologiques. Dans les maladies auto-immunes, l’hyposialylation peut contribuer à une activation immunitaire effrénée et à des dommages aux organes, car l’acide sialique aide à discriminer les antigènes du soi et à réguler les réponses inflammatoires7. À l’inverse, l’hypersialylation se traduit par la surexpression de sialoglycanes, tels que le sialyl-Tn, les antigènes sialyl-Lewis, l’acide polysialique et les gangliosides, ce qui constitue une caractéristique de certains cancers 8,9. L’hypersialylation dépend également de l’augmentation de l’expression d’enzymes spécifiques telles que la N-acétylglucosaminyltransférase (GNT-V), qui génère des glycanes hypersialylés tri- et/ou tétra-antennaires liés à l’azote, qui ont été associés à la croissance du cancer et aux métastases10. La teneur en acide sialique régule également la stabilité et la fonction des protéines, qui sont essentielles pour le rôle des acteurs oncogènes pertinents11. Par conséquent, une sialylation accrue peut faciliter le développement de tumeurs, de métastases, de résistance aux médicaments et d’évasion immunitaire. De plus, la régulation positive des sialoglycanes permet aux tumeurs d’interagir avec les récepteurs inhibiteurs de Siglec sur les cellules immunitaires et d’éviter la surveillance immunitaire. Pour cette raison, les sialoglycanes sont maintenant considérés comme des points de contrôle glyco-immuns et des cibles thérapeutiques attrayantes. Par exemple, les inhibiteurs de l’axe Siglec-immune font déjà l’objet d’essais cliniques précoces, car le récepteur des cellules immunitaires Siglec (LECtine de type immunoglobuline liant l’acide sialique) joue un rôle immuno-inhibiteur12.
Les enzymes ont été utilisées pour moduler le profil glycane en tant qu’outils d’étude ou de stratégies thérapeutiques13,14. La sialidase a été utilisée pour modifier la malignité des cellules cancéreuses, car les glycanes sialylés tels que le sialyl Lewis X sont essentiels à la migration cellulaire et aux métastases cancéreuses15. Dans le même temps, les inhibiteurs de la sialidase, qui empêchent le clivage de l’acide sialique, ont atteint les cliniques pour le traitement des infections virales dépendantes de l’acide sialique16. Récemment, la modulation de l’acide sialique a suscité un intérêt accru en raison du rôle essentiel des acides sialiques en tant que ligands dans l’axe Siglec-immun, ce qui signifie qu’ils offrent de nouveaux moyens de réduire l’échappement du cancer aux réponses immunitaires. Cet intérêt a été renforcé par la contribution de la lauréate du prix Nobel 2022 Bertozzi et de son équipe à plusieurs stratégies qui clivent sélectivement divers sialoglycanes et améliorent les réponses immunitaires anticancéreuses17. Ainsi, les stratégies à base de saliidase représentent une modalité prometteuse pour la thérapie glyco-immunitaire des points de contrôle. Le glycophénotype des cellules du système immunitaire dépend du type de cellule et de leur statut d’activation. En ce qui concerne les lymphocytes T, les glycanes jouent un rôle clé dans les étapes physiopathologiques du développement des lymphocytes T et de la sélection des thymocytes, de l’activité, de la différenciation et de la prolifération des lymphocytes T18. Par exemple, la polylactosamine sur les glycoprotéines influence les niveaux basaux des lymphocytes B et des lymphocytes T et l’activation des macrophages19. Dans les macrophages, des profils d’expression de glycanes distincts jouent un rôle important dans le recrutement des macrophages dans le microenvironnement tumoral (ETM)20. Par conséquent, l’expression de glycanes liés à l’O et à l’Azote par les cellules immunitaires pourrait être utilisée comme glycobiomarqueurs potentiels pour des approches thérapeutiques dans le traitement du cancer et des maladies auto-immunes.
Les cellules dendritiques (DC) sont des cellules présentatrices d’antigènes spécifiques ayant une capacité unique à déclencher des réponses immunitaires, telles que l’immunité anticancéreuse21. Les CD doivent subir une régulation à la hausse de leurs molécules de CMH présentatrices d’antigènes pour présenter des antigènes aux lymphocytes T (signal 1), des molécules co-stimulatrices pour activer les lymphocytes T (signal 2) et des cytokines pro-inflammatoires, telles que l’IL-12, pour déclencher la prolifération des lymphocytes T auxiliaires de type 1 (signal 3)22. Le profil immunitaire qui en résulte est étroitement régulé et les points de contrôle sont essentiels pour empêcher les cellules saines d’être attaquées. Étant donné que les DC peuvent stimuler diverses réponses immunitaires contre les cellules tumorales, ils sont utilisés comme vaccins à base de cellules, et un nombre important d’études cliniques ont démontré leurs avantages potentiels23,24. Après l’approbation par la FDA du premier vaccin à base de DC en 201025,26, de nombreux autres vaccins à base de DC ont été développés. Les vaccins à base de DC sont principalement produits ex vivo et administrés aux patients pour susciter des réponses immunitaires contre les tumeurs. Cependant, une maturation insuffisante ou brève est actuellement l’un des facteurs limitant l’efficacité clinique des DC et signifie que des cocktails de cytokines coûteux doivent être utilisés. Sans maturation adéquate, les DC ne peuvent pas activer les lymphocytes T dans des circonstances cliniques. Au lieu de cela, les DC expriment des points de contrôle immunitaires et déclenchent une réponse immunitaire tolérogène qui empêche les lymphocytes T cytotoxiques d’agir contre les cellules tumorales.
Les DC humains ont des surfaces fortement sialylées, et cette sialylation diminue avec la maturation et au cours d’une réponse immunitaire globale27. La maturation des DC peut être induite par l’élimination de ces acides sialiques avec la sialidase. La désialylation régule fortement à la hausse diverses cytokines, y compris l’IL-12, en raison de la translocation du facteur de transcription NF-kB vers le noyau 6,28. De plus, la désialylation améliore la présentation croisée de l’antigène par le biais des réponses immunitaires du CMH-I et des antitumoraux29,30. En conséquence, le knock-out des sialyltransférases ST3Gal.l et ST6Gal.l, qui jouent un rôle majeur dans la sialylation des DC, génère un phénotype plus mature chez les DCmurins 31.
Le traitement par la sialidase fournit une méthode pour stimuler tous les aspects de la maturation des DC, y compris l’augmentation de la présentation de l’antigène, l’augmentation de l’expression des molécules co-stimulatrices et l’augmentation de la production de cytokines, afin de remédier aux lacunes mentionnées ci-dessus et de permettre aux DC de susciter des réponses efficaces. Cet article présente une procédure permettant d’obtenir des DC humains désialysés viables par l’utilisation d’une saliidase bactérienne. Les DC désialylés présentent un profil de maturation amélioré et peuvent être utilisés comme modèles cellulaires pour stimuler les réponses immunitaires antitumorales in vitro. Les DC sont obtenus à partir de monocytes sanguins, qui sont ensuite différenciés in vitro en présence de la cytokine interleukine-4 (IL-4) et du facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytes (GM-CSF). Ce travail décrit également des méthodes basées sur la lectine pour analyser l’acide sialique à la surface des cellules et des méthodes pour immunophénotyper le niveau de maturation DC. La procédure décrite ici peut être utilisée pour désialyler d’autres types de cellules, fournissant ainsi une approche pour étudier le rôle des sialoglycanes, qui sont des points de contrôle glyco-immunitaires vitaux et pertinents dans l’immunomodulation.
Isolement des monocytes
Ce manuscrit décrit un protocole permettant de générer des mo-DC à partir de monocytes CD14+ isolés chez l’homme (Figure 1A), suivi d’un traitement à la sialidase pour réduire la teneur en acide sialique à la surface de ces cellules.
Il existe différentes façons d’obtenir des DC humains, par exemple directement à partir du sang ou des tissus périphériques ou par différenciation à partir de précurseurs tels que les cellules souches ou les monocytes. L’obtention de DC différenciés des monocytes isolés du sang périphérique est beaucoup plus simple en raison de la facilité d’obtention de grandes quantités de monocytes par rapport à d’autres sources de DC41. Néanmoins, pour obtenir un pourcentage élevé de monocytes isolés, toutes les étapes du protocole doivent être suivies scrupuleusement. Par exemple, le milieu de gradient de densité peut être toxique pour les cellules, et pour prévenir la mort cellulaire, il faut éviter tout contact prolongé des cellules avec le milieu de gradient de densité et laver soigneusement les cellules. La manipulation cellulaire doit être effectuée le plus rapidement possible pour éviter la perte de viabilité cellulaire. À partir des PBMC, les monocytes peuvent être isolés par sélection positive à l’aide de la méthode de tri cellulaire activé magnétiquement (MACS), qui est une technologie appropriée pour produire un grand nombre de monocytes. De plus, par rapport à d’autres méthodes de sélection des monocytes, les mo-DC dérivés de monocytes isolés de MACS possèdent une plus grande capacité à stimuler l’activité antitumorale des lymphocytes T42. Dans ce protocole, une fois isolés, les monocytes ont été incubés avec de l’IL-4 et du GM-CSF pendant une période de 5 à 6 jours pour réaliser la différenciation en mo-DC immatures (Figure 1). Les résultats ont montré que morphologiquement (Figure 1A) et phénotypiquement (Figure 1B), les monocytes isolés se sont différenciés en mo-DC immatures. De plus, tout au long de la différenciation, les mo-DC ont perdu l’expression des marqueurs CD14 et ont gagné l’expression de CD1a et de MHC-II (Figure 1B), qui sont nécessaires à la présentation de l’antigène aux lymphocytes T.
L’isolement et la différenciation des monocytes en mo-DC sont des limites à ce protocole. Le processus d’isolement est une étape sensible qui doit être exécutée avec soin et rapidité pour éviter la mort cellulaire, et cette étape doit également être effectuée chaque fois que des mo-DC sont nécessaires pour une nouvelle expérience. Le processus de différenciation prend 5 à 6 jours, ce qui pose une difficulté en termes d’utilisation de cette méthode pour les analyses à haut débit. Néanmoins, la méthode d’isolement et l’utilisation de cytokines pour différencier les mo-DC sont utiles pour générer un grand nombre de mo-DC fonctionnels in vitro à des fins d’expérimentation. Les mo-DC générés dans ce protocole sont capables de subir un traitement à la sialidase, une cytométrie en flux, un ELISA, une microscopie confocale, etc., soulignant ainsi l’importance et l’utilité de cette méthode30.
Traitement des mo-DC immatures et de la sialidase
Les sialidases sont essentielles à la régulation de la sialylation et sont responsables de l’élimination des acides sialiques des glycanes de surface cellulaire. Dans les mo-DC, l’élimination de l’acide sialique par la sialidase conduit à la maturation de ces cellules, ce qui augmente la présentation croisée de l’antigène et l’activation ultérieure des lymphocytes T et l’activité antitumorale30.
Les mo-DC humaines immatures présentent une teneur élevée en acides sialiques liés à la surface des cellules α(2,6) et α(2,3)27 par rapport aux mo-DC matures31,43. De plus, l’élimination des acides sialiques en traitant les mo-DC avec de la sialidase améliore la maturation des DCs 28,30,31. La sialidase sélectionnée pour cette expérience provenait de la bactérie Clostridium perfringens. Pourtant, d’autres organismes produisent également des sialidases, telles que les bactéries Streptococcus pneumoniae, Vibrio cholerae, ou Salmonella typhimurium44, la sangsue Macrobdella decora45, et même Homo sapiens46, et les sialidases de ces organismes sont également utilisées expérimentalement. Cependant, chaque sialidase a des spécificités de substrat différentes. De plus, l’utilisation de l’enzyme sialidase peut avoir ses limites ; par exemple, la manipulation des mo-DC pendant le traitement peut stimuler davantage ces cellules. De plus, la quantité de sialidase et les temps d’incubation doivent être optimisés en fonction du type de cellules utilisées et de leur composition en acide sialique. L’élimination de l’acide sialique n’est pas un effet permanent mais plutôt un phénomène transitoire, car la cellule restaurera sa teneur en acide sialique à la surface de la cellule. Outre la sialidase, il existe d’autres méthodes pour réduire les molécules d’acide sialique à la surface des cellules, telles que l’utilisation d’inhibiteurs de la sialyltransférase, le knock-out des gènes de la sialyltransférase ou le blocage métabolique de l’acide sialique à l’aide de mimétiques de l’acide sialique47,48,49. Néanmoins, ces méthodes peuvent présenter des effets distincts sur les cellules, et outre la désialylation, la viabilité cellulaire doit être prise en compte. Le traitement enzymatique à la sialidase est une méthode pratique pour éliminer efficacement et transitoirement les acides sialiques de surface cellulaire tout en maintenant la viabilité cellulaire.
Dans ce travail, la sialidase a été ajoutée aux mo-DC immatures à la concentration de 500 mU/5 x 106 cellules/mL, et les cellules ont été incubées à 37 °C pendant 60 min. Le traitement a été réalisé à l’aide de RPMI-1640 sans sérum afin de préserver la viabilité cellulaire et d’éviter toute interaction entre les molécules sialylées présentes dans le sérum30. Le traitement par la sialidase peut être effectué avec d’autres tampons que le RPMI, tels que l’acétate de sodium de 50 mM, un pH de 5,1 (dans le cas de C. perfingens sialidase) ou un PBS50,51,52. Néanmoins, le RPMI-1640 est le milieu de culture le plus courant pour les DC car il maintient des conditions expérimentales constantes pendant la procédure, évite d’induire la maturation et réduit tout stress pouvant être causé par les tampons de sialidase ou PBS53,54,55,56. Après l’incubation avec la sialidase, il est essentiel de bien laver les cellules avec un milieu supplémenté en sérum pour garantir l’arrêt de la réaction enzymatique. La présence de molécules sialylées dans le sérum va entrer en compétition en tant que substrats pour la sialidase, assurant ainsi un arrêt rapide de la réaction.
Caractérisation des marqueurs de surface par cytométrie en flux et microscopie confocale
Pour la détermination du profil d’acide sialique, dans la section 3 du protocole, nous avons utilisé la coloration de la lectine suivie d’une cytométrie en flux et d’une microscopie confocale à balayage laser. Pour la procédure de coloration cellulaire, dans les deux cas, les concentrations de lectine et les conditions d’incubation ont été optimisées pour éviter l’agglutination et la mort des cellules. Il est essentiel d’effectuer l’incubation à 4 °C dans des tampons contenant au moins 2 % de FBS ou de BSA pour éviter une liaison non spécifique des lectines. Dans ce protocole, le RPMI-1640 contenant 10 % de FBS a été utilisé pour maintenir des conditions expérimentales constantes et éviter le stress cellulaire. En ce qui concerne la microscopie confocale, la fixation des cellules avant la coloration est essentielle pour préserver la morphologie, prévenir l’autolyse et maintenir l’antigénicité.
L’analyse du phénotype mo-DC par cytométrie en flux a montré que les mo-DC traités à la sialidase avaient une quantité significativement plus élevée de lectine PNA liée à la surface cellulaire par rapport aux lectines MMA et SNA, qui diminuait après le traitement par sialidase (Figure 2A). Comme on pouvait s’y attendre, la coloration du PNA a augmenté, car le PNA reconnaît les antigènes non sialylés, contrairement au MAA et au SNA, qui se lient directement aux acides α2,3- et α2,6-sialique, respectivement30. Cette coloration confirme l’élimination efficace des acides sialiques de la surface cellulaire à l’aide de ce protocole. Une autre méthode qui peut être utilisée pour valider le traitement et analyser la teneur en acide sialique de la surface cellulaire est la coloration de la lectine suivie d’une microscopie confocale, comme illustré à la figure 2B.
Outre les exemples précédents, il existe d’autres approches pour évaluer et caractériser la teneur en acide sialique, telles que le sondage de la lectine par western blot. D’autres lectines spécifiques de l’acide sialique sont également disponibles, telles que les Siglecs, un groupe de lectines qui ont une nette préférence pour les types et les liaisons d’acide sialique57. Outre l’utilisation de lectines dans l’une ou l’autre technique (cytométrie en flux, microscopie ou western blot), il est également possible de caractériser la teneur en acide sialique à l’aide d’anticorps ; Par exemple, les acides α2,8-sialiques peuvent être évalués par des anticorps tels que le clone 735, qui est spécifique de l’acide polysialique58. De plus, après un traitement par la sialidase, les cellules peuvent être testées fonctionnellement pour leur efficacité biologique ou thérapeutique en évaluant leur phénotype et leur capacité à activer les lymphocytes T40. En fait, comme le montrent les exemples fournis, les mo-DC traités à la sialidase ont montré un phénotype de maturation plus élevé, ainsi qu’une expression élevée des molécules présentatrices d’antigènes et co-stimulatrices.
De plus, les mo-DC traités à la saliidase peuvent être chargés d’antigènes et co-cultivés avec des lymphocytes T ou d’autres cellules, puis peuvent être étudiés en fonction du phénotype, du profil de sécrétion de cytokines ou d’autres caractéristiques. Dans l’exemple fourni, les données montrent que les mo-DC traités à la saliidase peuvent être chargés d’antigènes tumoraux, puis utilisés pour activer les lymphocytes T. En fait, les lymphocytes T résultants ont montré une sécrétion accrue d’IFN-γ, ce qui est en accord avec les rapports précédents sur l’effet de la pénurie d’acide sialique sur l’augmentation de la capacité des mo-DC à activer les lymphocytes T 27,28,29,30,31.
En conclusion, ce protocole montre une méthode réalisable, viable et pratique pour générer des mo-DC pour la manipulation de la teneur en acide sialique par traitement par la sialidase. Ce protocole présente une méthodologie qui peut servir différents objectifs et applications. Cette méthode peut non seulement jouer un rôle crucial dans la compréhension du rôle des acides sialiques dans la maturation et la réponse des cellules immunitaires, mais peut également être utilisée comme outil immunomodulateur.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs remercient le financement de l’AG 101079417 de la Commission européenne et de l’EJPRD/0001/2020 EU 825575 ; la Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) Portugal, dans le cadre des subventions FCT 2022.04607.PTDC, UIDP/04378/2020, UIDB/04378/2020 (UCIBIO) et LA/P/0140/2020 (i4HB). FCT-NOVA. et Stemmatters ont également été financés par le Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), par l’intermédiaire du Programa Operacional Regional do Norte (Norte 2020) pour le SI I& Projet DT DCMatters (NORTE-01-0247-FEDER-047212). Nous reconnaissons l’installation de Biolabs à FCT-NOVA et GLYCOVID NOVA Saude.
15 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E15-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
24-well plate | Greiner Bio-one | 662 160 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase |
50 mL conical tube | AstiK’s | CTGP-E50-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
7-Aminoactinomycin D (7-AAD) | BioLegend | 420404 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Annexin V | Immunotools | 31490013 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Attune Acoustic Focusing Flow Cytometer | Thermo Fisher Scientific | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs | |
BSA | Sigma – Aldrich | A3294-100G | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Determination of Sialic Acid Profile |
CD14 (Monoclonal TÜK4) | Miltenyi Biotec | 130-080-701 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
CD80 | Immunotools | 21270803 | Maturation Profiling of mo-DCs |
CD86 | Immunotools | 21480863 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Cell counting slides and trypan blue | EVE | EVS-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Centrifuge | Eppendorf | 5430 R | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Density gradient medium (Histopaque) | Sigma – Aldrich | 10771-100ML | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
EDTA | Gibco, ThermoFisher | 15400054 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Elisa kit (IFN-γ) | Immunotools | 31673539 | Maturation Profiling of mo-DCs |
EVE automated cell count | NanoEntek | 10027-452 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10500064 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) | Miltenyi Biotec | 130-093-864 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Human CD14 microbeads (Immunomagnetic beads) | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-1β | Sigma – Aldrich | I9401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-4 | Miltenyi Biotec | 130-093-919 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Interleukin (IL)-6 | Sigma – Aldrich | SRP3096 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
L-glutamine | Gibco | A2916801 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
LS column and plunger | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Maackia amurensis (MAA) lectin (MAA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1265-1 | Determination of Sialic Acid Profile |
MHC-I (HLA-ABC) | Immunotools | 21159033 | Maturation Profiling of mo-DCs |
MHC-II (HLA-DR) | Immunostep | HLADRA-100T | Maturation Profiling of mo-DCs |
Microtubes | AstiK’s | PCRP-E015-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Neuraminidase (Sialidase) | Roche | 11585886001 | Treatment of Cells with Sialidase |
Non-essential amino acids (NEAA) | Gibco | 11140-050 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Paraformaldehyde (PFA 2%) | Polysciences Europe | 25085-1 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Paraformaldehyde (PFA 4%) | Biotium | 22023 | Determination of Sialic Acid Profile |
Pasteur pipettes | Labbox | PIPP-003-500 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Peanut (Arachis hypogaea) Agglutinin (PNA) lectin (PNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1071 | Determination of Sialic Acid Profile |
Penicillin/streptomycin | Gibco | 15140163 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | NZYTech | MB18201 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Prostaglandin E2 (PGE2) | Sigma – Aldrich | P0409 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RBC lysis buffer | BioLegend | 420302 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
RPMI-1640 medium (containing 11.1 mM glucose) | Gibco | 31870074 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells; Treatment of Cells with Sialidase; Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – Biotinylated) | Vector labs | B-1305-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sambucus nigra lectin (SNA lectin – FITC) | Vector labs | FL-1301-2 | Determination of Sialic Acid Profile |
Sodium pyruvate | Thermofisher | 11360-070 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
SpectroMax190 | Molecular Devices | Maturation Profiling of mo-DCs | |
Streptavidin-PE | BioLegend | 405203 | Determination of Sialic Acid Profile; Maturation Profiling of mo-DCs |
Tetramethylbenzidine (TMB) | Sigma – Aldrich | T0440 | Maturation Profiling of mo-DCs |
Tumour necrosis factor-α (TNF-α) | Sigma – Aldrich | H8916 | Obtaining Monocyte-derived Dendritic Cells |
Zeiss LSM710 confocal microscope | Zeiss | Determination of Sialic Acid Profile |