Mouse Lumbar Vertebra 단축 압박 시험(하중 표면 임베딩 포함)

모든 실험 및 프로토콜은 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 실험동물 관리 및 사용 가이드(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)에 따라 수행되었으며 콜로라도 주립대학교-푸에블로 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Colorado State University-Pueblo Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다(프로토콜 번호: 000-000A-021). 동물 관리에 대한 자세한 절차는 이전에 5,6에서 설명되었습니다. 생쥐는 젊은, 성장하는 암컷 C57BL/6 쥐에 대한 대마씨 보충 식단의 효과를 조사하는 것을 목표로 하는 광범위한 연구의 일환으로 생후 3주에 얻어졌다(자료표 참조). 5주에서 29주까지, 생쥐는 세 가지 식단 중 하나로 자랐습니다: 대조군 (0% 대마씨), 50g/kg(5%) 대마씨, 또는 150g/kg(15%) 대마씨, 그룹 당 8마리의 생쥐 5,6. 연구 전반에 걸쳐, 쥐는 각자의 식단과 물에 대한 자유 접근을 가졌고, 폴리카보네이트 케이지에 한 쌍으로 수용되었으며, 12시간 빛:12시간 어두운 주기(06:00에서 18:00 사이에 조명이 켜진 상태)로 유지되었습니다. 쥐의 체중과 건강은 매주 평가되었으며, 모든 쥐는 불리한 건강 상태를 발전시키지 않고 연구를 성공적으로 완료했습니다. 생후 29주가 되었을 때, 마우스는 이소플루란 가스를 사용하여 깊이 마취되고 자궁경부 탈구를 통해 안락사되었다 5,6. 흉골에서 꼬리까지 복부 표면에 정중선을 절개하고 흉곽내, 복막내, 후복막 기관을 모두 사체에서 제거했습니다. 내장이 제거된 사체는 약 1년 후 발생한 척추 검사를 위한 뼈 절개 시점까지 -70°C에서 0.9% 염화나트륨 용액에 보존되었습니다. 1. 3점 벤딩 머신을 압축 시험기로 변환 3점 벤딩 머신7(재료 표 참조)의 부하 센서에 부착된 크로스헤드 빔의 나사를 풉니다(그림 1A,B). 자동 정렬 상단 플래튼을 크로스헤드 빔과 동일한 나사산을 사용하여 부하 센서( 재료 표 참조)에 나사로 고정합니다(그림 1C). 하단 지지대가 나중에 부착될 각 하단 지지대에 두 개의 수평 구멍을 뚫습니다(그림 1D). 스테인리스강 바닥 압반의 양쪽에 나사산을 두드려 하부 지지대의 뚫린 구멍에 맞춥니다(그림 1E). 나사산 육각 나사를 사용하여 하단 플래튼을 두 개의 하단 지지대에 고정하고 고정될 때까지 조입니다(그림 1F).알림: 육각 나사에는 하부 지지대 및 상단/하단 플래튼의 탭 구멍과 일치하는 나사산이 있어야 합니다. 자동 정렬 상단 플래튼을 사용하면 상단 플래튼과 하중 표면 사이에 균일한 접촉을 달성하는 데 도움이 될 수 있지만 척추체의 두개골 끝의 오목한 부분을 감안할 때 충분하지 않습니다. 하중 표면 처리 방법을 사용한 추가 준비가 필요합니다. 많은 산업/엔지니어링 재료보다 작고 약한 작은 동물 뼈에 대한 압축 시험기를 제작할 때 하중 센서의 하중 용량과 하중 프레임의 크기를 고려하는 것이 필수적입니다. 또한 정확한 결과와 원활한 작동을 위해 기계를 정기적으로 청소하고 윤활해야 합니다. 2. 압축 시험기의 변위 보정 상단 플래튼과 하단 플래튼 사이에 테스트 재료가 없는 상태에서 가벼운 접촉이 이루어질 때까지 상단 플래튼을 하단 플래튼 위로 내립니다(~0.3-0.5N 예압력). 일정한 하강 속도(~1mm/min)로 기계를 켜서 압축 테스트를 시작합니다. 기계적 시험의 데이터 수집을 위해 디지털 데이터 수집 소프트웨어( 재료 표 참조)를 사용하여 하중(N) 및 변위(mm) 측정값을 수집합니다.알림: 상단 및 하단 플래튼 사이에 재료가 없기 때문에 관찰된 모든 변위는 기계(Δx기계)(프레임, 로드셀, 플래튼, 커플링 등)의 변위로 인한 것입니다. 모든 뼈 샘플에서 얻을 수 있는 것보다 더 높은 힘에 도달할 때까지 일정한(즉, 단조로운) 속도로 상단 플래튼을 하단 플래튼 위로 계속 내립니다. 2.1단계부터 2.3단계까지 총 3회 반복합니다. 시스템 변위(Δx기계, mm)에 대한 데이터를 플로팅합니다. 적용된 하중(힘, N). 데이터에 가장 적합한 회귀선을 맞춥니다(그림 2A-D). 뼈 압박 테스트의 데이터가 포함된 스프레드시트에서 회귀 분석에서 제공하는 방정식을 사용하여 마우스 요추 압박 테스트의 데이터 포인트에 대해 기록된 변위(Δx총 기록)에 영향을 미치는 기계 변위(Δx기계)의 양을 결정합니다.참고: 예를 들어ample, 18N의 힘이 가해지고 2.730mm의 변위가 기록된 데이터 포인트를 고려하십시오(총 Δx 기록). 예제 3차 다항식 회귀 방정식(그림 2D) [Δx기계 = (4 × 10-7 x 적용 하중3) – (8 × 10-5 x 적용 하중2) + (0.0044 x 적용 하중)], 기록된 변위의 0.056mm는 기계 변위(Δx기계)로 인한 것입니다.Δx 총 기록 = Δx기계 + Δx시편 데이터 포인트에 대해 기록된 변위를 수정합니다.참고: 예를 들어 위의 예를 고려하십시오. 2.730mm의 변위가 기록되고(Δx총 기록) 기계 변위 (Δx기계)가 전체의 0.056mm를 설명하는 경우 관심 시편(즉, 뼈)이 받은 변위(Δx시편)는 2.664mm입니다. 따라서 2.664mm는 척추가 받은 실제 변위(Δx표본)이며 하중-변위 곡선 해석에 사용되는 값입니다.Δx시편 = Δx 총 기록 – Δx기계 모든 단일 표본(뼈)에 대해 수집된 모든 데이터 포인트에 대해 2.7-2.8단계를 반복합니다.참고: 이 단계는 압축 시험 중에 관찰된 변위가 시편의 변위로 인한 것일 뿐만 아니라 관찰된 변위가 기계 변위(Δx기계)(예: 프레임, 로드셀, 압반, 커플링 등의 압축/변위)와 시편(Δx시편). 따라서 작은 동물(예: 마우스)과 같이 상대적으로 적은 양의 변위를 겪는 시편의 경우 시스템 변위(Δx기계)로 인해 큰 오류가 발생할 수 있습니다. 시스템 변위를 보정하기 위해 여기에 설명된 절차는 이전에 Kalidindi와 Abusafieh28에 의해 보고되었으며, 여기에 설명된 방법 외에 두 가지 다른 방법도 자세히 설명합니다. 일부 연구자들은 시스템 변위(system displacement)17를 결정하기 위해 하나 이상의 방법을 사용하는 것으로 알려져 있다. 각 기계에 하중이 가해질 때 고유한 패턴과 시스템 변위 정도를 표시할 수 있습니다. 이러한 이유로 시스템 변위 보정 계수는 각 기계에 대해 결정되어야 하며 두 기계 간에 동일하지 않습니다. 척추뼈의 압축 시험과 달리, 상부와 하부 플래튼 사이에 재료가 없기 때문에 시스템 변위를 측정할 때 큰 힘 감소가 관찰되지 않습니다. 3. 쥐 사체에서 나온 제5 요추 (L5) 해부 냉동 쥐 사체를 실온에서 해동하고 0.9% NaCl의 등장성 용액을 정기적으로 도포하여 연조직과 뼈에 수분을 공급하도록 주의합니다. 꼬리 기저부 근처의 등쪽 정중선의 피부를 작게(<0.5cm) 절개한 다음 각 뒷다리를 가로질러 절단면을 확장하고 부드럽게 당겨 꼬리 기저부에서 동물의 머리까지 가죽을 제거합니다. 척추가 쉽게 보일 때까지 복벽 근육을 잘라냅니다. 해부 현미경으로 두 개의 천장관절과 천골의 두개골 끝을 시각화합니다. 면도날이나 메스를 사용하여 마지막 요추(L6)를 천골의 두개골 끝에서 분리하기 위해 미세하게 자릅니다. 다시 말하지만, 추간 공간 사이를 절단하여 척추에서 L6과 L5를 제거하고 분석을 위해 L5를 따로 둡니다(그림 3). 해부 현미경으로 척추를 검사하고 추간판을 포함한 뼈의 모든 연조직을 대부분 거즈 패드를 사용하고 필요한 경우 집게로 부드럽게 제거합니다.참고: 본 연구에서는 L5가 관심 척추로 선택되었지만 다른 요추는 압박 테스트를 위해 선택될 수 있습니다. 4. PMMA 골시멘트 매립법을 이용한 단축 압축시험을 위한 L5 척추 하중면 준비 회전 공구에 부착된 다이아몬드 절단 휠( 재료 표 참조)을 사용하여 각 척추경을 절단하여 횡돌기 및 가시돌기를 제거합니다(그림 4). 중심에 부착된 상태로 두면 척추 돌기가 중심 전체에 하중이 분산되는 것과는 반대로 과정 자체에서 상부/하부 압반과 국부적으로 접촉할 수 있습니다. 미세한 120방 사포( 재료 표 참조)를 사용하여 척추의 꼬리 끝을 부드럽게 샌딩하여 모든 추간판, 연조직 및 불규칙성을 제거합니다. 나중에 쉽게 식별할 수 있도록 샌딩된 꼬리 끝을 영구 마커로 표시하십시오. 제조업체의 지침에 따라 PMMA 뼈 시멘트를 혼합합니다( 재료 표 참조). PMMA 뼈 시멘트가 여전히 반쯤 부드러워진 상태에서 척추뼈의 두개골(표시가 없는) 끝이 위를 향하도록 하여 척추뼈가 식염수조에 있는 동안 전체 표면이 덮이도록 하여 뼈 샘플을 수분과 시원하게 유지합니다. PMMA가 여전히 반쯤 부드러운 상태에서 꼬리(표시된) 면이 아래를 향하도록 척추뼈를 바닥 플래튼에 놓습니다(그림 5). 기계를 켜서 구동 기어를 맞물리고 골시멘트와 접촉하고 PMMA가 뼈 표면에 고르게 분포되도록 최소한의 힘(<0.5N)이 가해질 때까지 상단 플래튼을 척추 + PMMA 골시멘트 복합체 위로 천천히 내립니다. 중립 위치의 상단 플래튼은 수평으로 추정할 수 있으며, 반 연질 PMMA를 누르면 PMMA가 척추 두개골 끝의 오목한 부분을 채우고 상단 플래튼 아래에 평평한 수평 표면을 형성합니다. 상단 플래튼이 PMMA 골 시멘트를 부드럽게 누른 상태에서 PMMA 골 시멘트가 완전히 굳을 때까지 샘플을 방해하지 않고 그대로 두십시오(본 연구에 사용된 PMMA 골 시멘트에 대한 제조업체 지침에 따라 ~10분). 샘플을 식염수 수조에 보관하거나 이 기간 동안 식염수로 자주 분무하여 샘플을 수분과 시원하게 유지합니다. PMMA 골시멘트가 완전히 굳으면 압축 시험을 시작할 수 있습니다. 기계적 테스트의 데이터 수집을 위해 설계된 디지털 소프트웨어를 사용하여 센서의 하중(즉, 힘)(N) 및 변위(즉, 처짐)(mm)에 대한 데이터를 실시간으로 스프레드시트로 수집합니다( 재료 표 참조). <0.5N의 최소 예압력으로 적용된 5초 동안 기준선 데이터 수집 후, 압축 테스트를 시작하기 위해 미리 결정된 단일(즉, 단조)의 하강 속도(~1mm/min)로 상부 플래튼을 샘플 위로 내리기 시작합니다. 하중(N)이 크게 감소하여 재료 고장이 관찰되면 데이터 수집을 중지합니다.알림: 제조업체 지침에는 PMMA 골시멘트의 대략적인 경화 시간이 명시되어 있습니다. PMMA 골시멘트의 경화 시간은 사용되는 PMMA 골시멘트의 종류에 따라 다를 수 있습니다. 제조업체 지침에 따라 PMMA 경화 대기 시간을 결정하십시오. 그러나 PMMA 골시멘트가 완전히 굳었다는 지표로서 PMMA 골시멘트의 추가 시료를 척추뼈에 놓을 시료와 동시에 혼합할 수 있지만 따로 보관하고 여전히 부드러운지 완전히 굳었는지 확인할 수 있습니다. 완전히 굳어지면 뼈의 PMMA도 뼈 + PMMA 복합체를 방해하지 않고 완전히 굳어짐을 나타낼 수 있습니다. 뼈 샘플은 PMMA 경화 및 테스트 기간 동안 수분이 풍부하고 시원한 상태를 유지해야 합니다. 건조한 공기에 몇 분만 노출되어도 생체역학적 특성이 변할 수 있습니다. 일부 연구자들은 식염수조(19)가 장착된 압축 시험기를 사용한다. 본 연구에서 압축 시험기에는 식염수 수조가 없었습니다. 대신, PMMA 경화 기간과 테스트 기간 동안 미세한 식염수 미스트를 정기적으로 도포했습니다. 5. L5 척추 단축 압축 시험을 위한 하중-변위 곡선 분석 스프레드시트에서 하중(N) 및 수정된 변위(mm) 데이터를 복사하여 기술 그래프 작성 및 데이터 분석 소프트웨어에 붙여넣습니다( 재료 표 참조). y축에 하중(N)이 있고 x축에 보정된 시편 변위(Δx시편, mm)가 있는 그래프를 생성합니다(그림 6). 먼저 Windows, 새 테이블을 클릭한 다음 Do it to make a table을 클릭하여 소프트웨어에서 이 작업을 수행합니다. 수정된 변위(mm) 및 로드(N) 데이터를 원시 데이터 스프레드시트에서 새 테이블로 복사합니다. 그런 다음 Data(데이터)를 클릭하여 원시 데이터를 나타내는 파형을 생성한 다음 XY Pair to Waveform(XY 쌍을 파형 으로 연결)을 클릭하고 X-Wave에 대한 보정된 변위 데이터를 선택하고 Y-Wave에 대한 데이터를 로드합니다. “Number of Points” 상자에 올바른 데이터 포인트 수가 있는지 확인하고 파형의 이름을 지정한 다음 Make Waveform을 클릭합니다. 파형이 만들어지면 Windows를 클릭한 다음 새 그래프를 클릭하여 그래프를 생성하고 파형을 Y축에 배치하고 X축에 “계산”합니다. 커서 도구를 사용하여 분석을 위해 그래프에 관심 있는 포인트/영역을 표시합니다. 일반적인 전체 골격의 기계적 특성을 계산하기 위한 몇 가지 관심 지점/영역은 5.4-5.8단계(그림 6)에 언급되어 있으며, 여기에는 공품-실패 (N x mm), 최대 하중 (N), 강성 (N/mm), 항복 하중 (N) 및 항복 후 변위 (mm)가 포함됩니다. 재공품(N x mm)을 계산하려면 테스트 시작 지점에 커서(A)를 놓고 재료가 파손되기 직전 지점(즉, 하중이 크게 감소하기 전에 테스트 중에 도달한 최대 하중)에 커서(B)를 놓습니다.알림: 따라서 커서 AB는 재료가 힘을 견디기 시작하고 재료가 파손되는 지점까지 변위를 겪기 시작할 때부터 전체 테스트를 브래킷으로 묶습니다. 공품-실패 (N x mm)는 곡선 아래의 전체 면적(즉, 커서 A와 B 사이의 곡선 아래 면적)으로 측정할 수 있습니다. 최대 하중(N)을 테스트 중에 관찰된 하중(즉, 커서 B에서의 하중)에 대한 가장 높은 값으로 계산합니다. 재료의 강성 (N/mm)을 선형 탄성 영역의 기울기(즉, 커서 C와 D 사이의 기울기)로 계산합니다. 항복 하중(N)은 하중-변위 곡선이 선형성에서 벗어나 소성 영역으로 들어가 영구적인 변형(즉, 점 D에서의 하중)을 유지하는 하중입니다. 커서 D에서 하중을 측정하여 이를 계산합니다. 항복 후 변위(mm)는 재료의 연성을 나타내는 지표입니다. 이를 항복점과 재료 파손 지점 사이의 변위(즉, 커서 D와 B 사이의 변위)로 측정합니다.참고: 위에 나열된 매개변수는 보고된 일반적인 전체 뼈 기계적 특성 중 일부일 뿐입니다. 하중-변위 곡선에서 얻을 수 있는 모든 전체 골격 기계적 특성의 전체 목록은 아닙니다. 다른 전체 뼈 기계적 특성 매개변수에는 총 변위(mm), 흡수된 탄성 에너지(N x mm), 탄성 변위(mm), 흡수된 플라스틱 에너지(N x mm) 및 소성 변위(mm)가 포함됩니다. 또한, 조직 수준의 뼈 기계적 특성은 나열되지 않습니다. 이를 위해서는 뼈 직경과 같은 특정 해부학적 측정값을 사용한 데이터 변환이 필요합니다. 소프트웨어의 하중-변위 곡선에서 측정하기 위한 예제 코드는 보충 파일 1에 나열되어 있습니다.