Maus Lendenwirbel Uniaxiale Kompressionsprüfung mit Einbettung der Belastungsfläche
Summary
In diesem Protokoll werden zwei Ansätze beschrieben, um die uniaxiale Kompressionsprüfung von Lendenwirbeln von Mäusen leichter zugänglich zu machen. Zunächst wird der Umbau einer Dreipunktbiegemaschine zu einer Druckprüfmaschine beschrieben. Zweitens wird ein Einbettungsverfahren zur Vorbereitung der Belastungsfläche, das Knochenzement verwendet, für die Lendenwirbel von Mäusen angepasst.
Abstract
Es gibt ein zunehmendes Bewusstsein dafür, dass kortikaler und spongiöser Knochen sich in der Regulierung und Reaktion auf pharmazeutische Therapien, Hormontherapien und andere Behandlungen für altersbedingten Knochenschwund unterscheiden. Die Drei-Punkt-Biegung ist eine gängige Methode, um den Einfluss einer Behandlung auf die mittlere Diaphysenregion der Röhrenknochen zu beurteilen, die reich an kortikalem Knochen ist. Uniaxiale Kompressionstests von Mauswirbeln sind zwar in der Lage, Knochen zu beurteilen, die reich an spongiösem Knochen sind, werden aber aufgrund technischer Herausforderungen seltener durchgeführt. Noch seltener wird die Kombination von Dreipunktbiege- und Drucktests durchgeführt, um festzustellen, wie eine Behandlung die mittlere Diaphyse eines langen Knochens und ein Wirbelzentrum ähnlich oder unterschiedlich beeinflussen kann. Hier beschreiben wir zwei Verfahren, um die Druckprüfung von Lendenwirbeln von Mäusen parallel zum Dreipunktbiegen zu einer weniger anspruchsvollen Methode zu machen: erstens ein Verfahren zur Umwandlung einer Dreipunktbiegemaschine in eine Druckprüfmaschine und zweitens eine Einbettungsmethode zur Vorbereitung einer Lendenwirbelbelastungsfläche der Maus.
Introduction
Altersbedingte Knochenveränderungen werden aufgrund des damit verbundenen erhöhten Risikos für Knochenbrüche weithin als problematisch angesehen. Knochenbrüche beim Menschen können zu chronischen Schmerzen, eingeschränkter Mobilität, langfristigen Behinderungen, einem erhöhten Sterberisiko und wirtschaftlichen Belastungen führen1. Zu den gängigen Therapien, die untersucht werden, um die Symptome altersbedingter Knochenveränderungen zu behandeln, gehören Nahrungsergänzungsmittel, Hormonbehandlungen und Medikamente 2,3,4,5,6,7,8,9. Erste Untersuchungen solcher Behandlungen für menschliche Probanden werden üblicherweise unter Verwendung von Kleintiermodellen (z. B. Laborratten und Mäusen) durchgeführt, die die beiden Haupttypen von Knochen besitzen, die im menschlichen Skelett gefunden wurden10. Lange Blinddarmknochen wie Oberarmknochen, Oberschenkelknochen und Schienbein sind reich an kortikalem (d. h. kompaktem) Knochen, während Wirbel reich an spongiösem Knochen (d. h. gewebtem, schwammigem oder trabekulärem Knochen) sind4. Es gibt immer mehr Erkenntnisse darüber, dass sich die Mechanismen der Knochenregulation und der Signalwege zwischen kortikalem Knochen (z. B. Mitteldiaphyse des langen Knochens) und spongiösem Knochen (z. B. Wirbelzentrum) unterscheiden2. Aus diesem Grund können Therapien unterschiedliche Effekte haben, die knochenspezifisch oder sogar ortsspezifisch innerhalb desselben Knochens sind 2,3,4.
Die Anwendung von Kraft auf ein Objekt (z. B. Knochen) führt dazu, dass das Objekt je nach den Randbedingungen des Objekts beschleunigt, verformt oder verformt wird. Wenn der Knochen eingeengt ist, widersetzt sich eine entgegengesetzte Kraft gleicher Größe der Beschleunigung des Knochens, und es kommt zu einer Verformung. Wenn sich der Knochen verformt, entsteht ein innerer Widerstand, der als Spannung bezeichnet wird und von dem es zwei grundlegende Arten gibt: Normalkraft in Form von Zug oder Druck und Scherkraft10. Häufig wird eine Kombination der Grundarten von Spannungen erzeugt, abhängig vom aufgebrachten Kraftsystem10. Die Stärke eines Materials ist seine Fähigkeit, Belastungen standzuhalten, ohne zu versagen. Wenn immer größere Kräfte auf ein Material ausgeübt werden, erfährt es schließlich eine dauerhafte Verformung, an der es von einem elastischen Zustand (d. h. es kehrt in seine ursprüngliche Form zurück, wenn die Kraft entfernt wird) in einen plastischen Zustand übergegangen ist (d. h. es kehrt nicht in seine ursprüngliche Form zurück, wenn die Kraft entfernt wird)11. Der Punkt, an dem der Übergang von einem elastischen in einen plastischen Zustand erfolgt, wird als Streckgrenze bezeichnet. Da über die Streckgrenze hinaus noch größere Kräfte auf das Material ausgeübt werden, kommt es zunehmend zu Mikrobrüchen (d. h. Schäden), bis es zu einem vollständigen Bruch kommt. Zu diesem Zeitpunkt soll das Material versagt haben11,12. Die Fraktur eines Knochens stellt ein Versagen sowohl auf struktureller als auch auf Gewebeebenedar 10. Zum Beispiel tritt der Bruch eines Wirbelknochens auf, weil nicht nur mehrere Trabekel auf struktureller Ebene versagen, sondern auch extrazelluläre Matrixelemente wie Kollagen und Hydroxylapatitkristalle in einer einzelnen Trabekel auf Gewebeebene.
Die mechanischen Ereignisse, die zum Versagen eines Materials führen, können mit einer Vielzahl von Prüfmethoden gemessen werden. Die Dreipunktbiegung ist eine gängige Methode, um die mechanischen Eigenschaften von Röhrenknochen aus dem Blinddarmskelett zu testen. Diese Methode ist einfach und reproduzierbar, was sie für viele Forscher zur bevorzugten Methode biomechanischer Tests macht13. Durch das Absenken eines Kreuzkopfbalkens auf die mittlere Diaphyse eines langen Knochens, der auf zwei unteren Stützbalken ruht, werden bei dieser Methode gezielt die mechanischen Eigenschaften der mittleren Diaphyseregion getestet, bei der es sich um einen dicht organisierten kortikalen Knochen handelt. Aus Last-Weg-Kurven lassen sich unter anderem Zugkrafteinflüsse auf Elastizität, Zähigkeit, Kraft bis zum Versagen und den Übergang vom elastischen zum plastischen Verhalten von Knochenmaterialien bestimmen.
Bei der zweiten Art von Knochen, die als trabekulärer, schwammiger, gewebter oder spongiöser Knochen bezeichnet wird, werden Knochenelemente zu einer Reihe von Stäbchen und Balken geformt, die als Trabekel bezeichnet werden, was ihnen ein “schwammiges” Aussehen verleiht. Die Hauptwirbelkörper (d. h. Centra) sind reich an spongiösem Knochen und sind beim Menschen häufig die Lokalisationen altersbedingter Kompressionsknochenbrüche14. Lendenwirbel (d. h. Wirbel des unteren Rückens) sind die größten Wirbel, tragen den größten Teil des Körpergewichts und sind die häufigste Stelle für Wirbelbrüche15,16. Die mechanischen Eigenschaften von Wirbelkörpern lassen sich am besten direkt mit uniaxialen Druckprüfverfahren beurteilen, da die axiale Kompression die normale Kraftbelastung ist, die in vivo auf Wirbelsäulen ausgeübt wird 17. Die Kompression der Wirbelkörper in vivo erfolgt als Folge von Muskel- und Bänderkontraktionen, der Schwerkraft und Bodenreaktionskräften18.
Ex-vivo-Kompressionstests von Kleintierwirbeln können aufgrund ihrer geringen Größe, unregelmäßigen Form und Zerbrechlichkeit schwierig sein. Die Form der Wirbelkörper kann als Parallelogramm mit leichter ventraler Kippung und leichter kranialer Konkavität abgeschätzt werden17. Diese Form stellt eine Herausforderung für die Durchführung von uniaxialen Druckprüfungen ex vivo dar, da ohne angemessene Vorbereitung der Belastungsfläche Druckkräfte nur auf einen Teil der Belastungsfläche ausgeübt werden, was zu einem “lokalen Kontakt” führt17,19. Dies kann zu inkonsistenten Ergebnissen und vorzeitigem Ausfall führen19. Dies ist in vivo nicht der Fall, da die Belastungsfläche an den Wirbelgelenken von Bandscheiben umgeben ist, wodurch die Last über die kraniale Endplatte verteilt werden kann. Der Bandscheiben-Schädel-Endplatten-Komplex spielt eine wichtige Rolle bei der Krafteinleitung über den gesamten Wirbelkörper und der Biomechanik der Fraktur auf den Wirbelkörper14,20. Während die Kompressionsprüfung auf dem Gebiet der Biologie nicht neu ist, gibt es Einschränkungen bei den derzeitigen Methoden der mechanischen Prüfung von Knochen. Zu diesen Einschränkungen gehören das Fehlen von Prädiktormodellen und Simulationen für die Knochenmechanik, eine einzigartige geometrische Raumarchitektur und sogar inhärente probenbasierte biologische Variationen21. Noch wichtiger ist, dass das Feld durch eine mangelnde Standardisierung zwischen den Methoden und einen allgemeinen Mangel an berichteten Methoden in der Literatur herausgefordert wird22.
In der Literatur werden zwei Methoden zur Präparation von Nagetier-Lendenwirbeln beschrieben, um eine einachsige Kompressionsprüfung zu erreichen: die Schneidemethode und die Einbettungsmethode 17,19,23,24,25,26. Das Schneideverfahren erfordert, dass die Wirbelfortsätze, die kraniale Endplatte und die kaudale Endplatte aus dem Wirbelkörper herausgeschnitten werden. Pendleton et al.19 haben bereits über eine detaillierte Methode zur Anwendung dieser Methode an Lendenwirbeln von Mäusen berichtet. Diese Methode stellt die Herausforderung dar, perfekt parallele Schnitte sowohl an der kaudalen als auch an der kranialen Endplatte zu erzielen und gleichzeitig eine Beschädigung der Probe zu vermeiden. Es hat auch die Einschränkung, dass die kraniale Endplatte entfernt wird. Die kraniale Endplatte enthält eine dichte Hülle aus kortikalem Knochen und spielt eine wichtige Rolle bei der Verteilung von Lasten aus den Bandscheiben in vivo und ist am Versagen des Knochens bei in vivo Frakturen beteiligt 17,20,27. Im Gegensatz dazu werden bei der Einbettungsmethode die Wirbelfortsätze entfernt, während die kraniale Endplatte des Wirbelkörpers intakt bleibt. Die Belastungsfläche wird dann annähernd horizontal hergestellt, indem eine kleine Menge Knochenzement auf das kraniale Ende des Wirbelkörpers aufgetragen wird. Diese Methode hat den Vorteil, dass sie die technischen Herausforderungen, die mit der Schneidemethode verbunden sind, überwindet und den Mechanismus der Lastaufbringung und des Knochenversagens in vivo aufgrund der Erhaltung der kranialen Endplatte besser nachahmen kann. Dieser Ansatz wurde bereits in Studien dokumentiert, in denen uniaxiale Kompressionstests an Rattenknochen durchgeführt wurden. Soweit uns bekannt ist, wurde es jedoch bisher nicht im Zusammenhang mit kleineren Lendenwirbeln der Maus dokumentiert 17,25,26. Die fragliche Methode wurde zuvor von Chachra et al.25 detailliert beschrieben und verwendete ursprünglich eine Knochenprobe, die zwischen zwei Platten mit jeweils einem zylindrischen Hohlraum gehalten und dann mit Polymethylmethacrylat (PMMA) gefüllt wurde. Dieselbe Forschungsgruppe verbesserte später die Methode, bei der ein Ende sanft geschliffen (kaudal) und das andere Ende mit einem kleinen Fleck Knochenzement (kranial) versehen wird26. Diese Methode ist eine Verbesserung gegenüber der vorherigen Methode, da sie das Material zwischen den Platten minimiert und im Mittelpunkt dieses Artikels steht. Trotz der Herausforderungen, die mit der uniaxialen Wirbelkompressionsprüfung verbunden sind, handelt es sich um eine Methode, die wertvolle Informationen über die Auswirkungen einer vorgeschlagenen Therapie auf den Knochen liefern kann, insbesondere in Kombination mit der Dreipunktbeugung.
Hier wird der Einsatz einer umrüstbaren Dreipunkt-Biege-/Druckprüfmaschine vorgestellt, die eine einfache Prüfung sowohl von langen Knochen als auch von Wirbelkörpern mit einer einzigen Maschine ermöglicht. Des Weiteren wird die Verwendung eines Einbettungsverfahrens zur Erzielung einer einachsigen Kompressionsprüfung von Lendenwirbeln von Mäusen vorgestellt. Die vorliegende Studie wurde als Teil einer größeren Studie durchgeführt, die darauf abzielte, die Einflüsse einer Nahrungsergänzung mit Hanfsamen auf die Eigenschaften des Skelettknochens bei jungen, wachsenden weiblichen C57BL/6-Mäusen zu untersuchen 5,6. Der Dreipunkt-Biegetester wurde ursprünglich von Dozenten und Studenten der Ingenieurabteilung der Colorado State University-Pueblo entwickelt und von unserer Forschungsgruppe in Dreipunkt-Biegetests an langen Knochen [Oberschenkelknochen und Schienbein der Ratte7 und Oberarmknochen, Oberschenkelknochen und Schienbein der Maus 5,6,8,9 ]. Seine Modifikation und Anwendung für den Einsatz bei Wirbelkörperkompressionstests an Mäusen wurde jedoch nicht untersucht. Die Konstruktion und der Aufbau der Dreipunktbiegemaschine wurden bereitsbeschrieben 7. Dieser Bericht konzentriert sich auf Methoden, die verwendet werden, um die Maschine für die Druckprüfung zu modifizieren und die Systemverschiebung zu korrigieren. Zweitens wird die Einbettungsmethode für die Oberflächenpräparation von Wirbelkörperbelastungen von Mäusen beschrieben, zusammen mit Methoden für einachsige Drucktests und die Analyse von Last-Weg-Daten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Aufbau einer umrüstbaren Dreipunktbiegemaschine/Druckprüfmaschine sowie die Verwendung eines PMMA-Knochenzement-Einbettungsverfahrens zur Präparation von Lendenwirbelproben von Mäusen vor dem uniaxialen Druckversuch zu beschreiben. Für die Knochenproben wurden deskriptive Statistiken erstellt und berichtet, die für den Vergleich in zukünftigen Studien nützlich sein werden. In der vorliegenden Studie wurden einige der am häufigsten berichteten mechanischen Eigenschaften des gesamten Knochens analysiert. Es ist jedoch erwähnenswert, dass es mehrere zusätzliche mechanische Eigenschaften auf Ganzknochen- und Gewebeebene gibt, die hier nicht untersucht wurden.
Es bleibt unklar, wie sich die mechanischen Eigenschaften von Proben, die mit der Einbettungsmethode hergestellt wurden, mit denen vergleichen, die mit der Schneidemethode für Lendenwirbel von Mäusen hergestellt wurden. Schumancher17 untersuchte zuvor die mechanischen Eigenschaften von Rattenwirbeln, die mit den beiden verschiedenen Methoden hergestellt wurden, und stellte fest, dass Wirbel, die mit der Einbettungsmethode hergestellt wurden, eine signifikant geringere Steifigkeit, eine höhere Streckgrenze und eine höhere Streckdehnung aufwiesen als Proben, die mit der Schneidmethode hergestellt wurden. Weitere Charakterisierungen sind erforderlich, um zu verstehen, wie sich die wirbelmechanischen Eigenschaften von Mäusen oder anderen Tiermodellen vergleichen, wenn sie mit den beiden verschiedenen Methoden der Belastungsoberflächenpräparation gemessen werden. Es ist zu erwarten, dass sich einige Parameter zwischen den Wirbeln unterscheiden, die mit unterschiedlichen Methoden präpariert wurden, da die Einbettungsmethode der Probe Material hinzufügt, aber die Endplatte erhält, die eine wichtige Struktur bei Wirbelfrakturen in vivo darstellt 17,27. Die Zugabe von Knochenzement zum Schädelende erhöht die Probe an die Höhe, während das Schneiden der Endplatten die Höhe entfernt, wodurch sich das Aspektverhältnis ändert und dadurch die mechanischen Eigenschaften wie die Steifigkeit verändert werden. Obwohl PMMA steifer ist als Wirbelspongiosa, ist es möglich, dass das PMMA eine Verschiebung erfährt, und das Ausmaß dieser Verschiebung muss weiter charakterisiert werden. Darüber hinaus ist unklar, wie sich die Ergebnisse der Einbettungs- oder Schneidemethode mit den Vorhersagen von Knochenparametern unter Verwendung der Finite-Elemente-Analyse für Mauswirbel vergleichen lassen oder wie die Ergebnisse unter verschiedenen Bedingungen variieren (z. B. Verringerung der Geschwindigkeit, unterschiedliche Wirbelebenen, PMMA-Zusammensetzung). Da jedoch alle Proben auf ähnliche Weise vorbereitet werden, ist diese Methode angemessen und ermöglicht eine einfache und kostengünstige Möglichkeit, Vergleiche zwischen Behandlungsgruppen in einer einzigen Studie anzustellen, in der die Proben unter ähnlichen Bedingungen vorbereitet und getestet werden.
Bei der Probenvorbereitung vor der Druckprüfung ist es wichtig, die Proben reproduzierbar vorzubereiten. Eine mögliche Einschränkung des in der vorliegenden Studie beschriebenen Verfahrens ist die Verwendung eines rotierenden Werkzeugs zur Entfernung der Wirbelfortsätze. Eine andere Methode zur Entfernung der Wirbelfortsätze von Lendenwirbeln von Mäusen wurde von Pendleton et al.19 beschrieben, die eine konsistentere Probenvorbereitung ermöglichen könnte. Des Weiteren können durch das Auftragen von PMMA-Knochenzement Inkonsistenzen entstehen. Daher ist es wichtig, den Knochenzement in Bezug auf Volumen, Platzierung und Aushärtungszeit gleichmäßig aufzutragen. Die Einbettungsmethode kann jedoch im Vergleich zur Schneidmethode ein einfacheres Mittel zur Erzielung einer konsistenten Probenvorbereitung darstellen, da es aufgrund ihrer geringen Größe und Zerbrechlichkeit schwierig sein kann, perfekt gleichmäßige, parallele Schnitte zwischen allen Proben konsistent zu erzielen. Zukünftige Studien werden erforderlich sein, um die Genauigkeit der Ergebnisse zu bewerten, die aus Proben gewonnen werden, die mit dem Embedding vs. Schneideverfahren.
Wie bereits erwähnt, sind weitere Charakterisierungen und Untersuchungen der Einbettungsmethode für die Probenvorbereitung von Lendenwirbeln von Mäusen vor uniaxialen Kompressionstests erforderlich. Nichtsdestotrotz zeigt diese Studie, dass eine solche Methode eingesetzt werden kann, liefert eine detaillierte Beschreibung der vorgeschlagenen Methode und bietet deskriptive Statistiken der Parameter, die aus Proben gemessen wurden, die mit der Methode hergestellt wurden. Dieses Protokoll ist aufgrund des derzeitigen Mangels an verfügbarer Methodik für das Feld wertvoll. Darüber hinaus kann diese Methode im Vergleich zu anderen Methoden den Mechanismus, durch den In-vivo-Wirbelfrakturen auftreten, besser nachahmen17,27. Die Methode hat auch den Vorteil, dass sie die technischen Schwierigkeiten überwindet, die mit anderen derzeit berichteten Methoden verbunden sind, was die uniaxiale Kompressionsprüfung in der Knochenforschung praktikabler macht. Dies ist besonders bedeutsam, da Medikamente, Diäten oder andere Eingriffe kortikalreiche Knochen (z. B. lange Knochen in der Mitte der Diaphyse) und trabekularreiche Knochen (z. B. Wirbelkörper) unterschiedlich beeinflussen können, die Drei-Punkt-Biegung jedoch die vorherrschende Methode zur Beurteilung der mechanischen Eigenschaften von Knochen ist13. Die Kombination von Dreipunktbiege- und einachsiger Druckprüfung kann durch den Einsatz einer umrüstbaren Dreipunkt-Biege-/Druckprüfmaschine noch einfacher bewerkstelligt werden. Daher schlägt die vorliegende Studie zwei mögliche Mittel vor, um die Beurteilung sowohl von kortikalem als auch von trabekulärem Knochen in derselben Studie für Forscher zugänglicher zu machen, was möglicherweise zu einem besseren Verständnis führt, wie sich eine bestimmte Behandlung auf verschiedene Knochentypen zwischen den Versuchsgruppen auswirkt.
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir sind dankbar für die erheblichen Anstrengungen, die das Department of Engineering der Colorado State University-Pueblo beim Bau der Dreipunktbiegemaschine und ihrer Modifikation zu einer umrüstbaren Dreipunkt-Biege-/Druckprüfmaschine unternommen hat. Besonders dankbar sind wir Herrn Paul Wallace, dem Koordinator der Maschinenwerkstatt, für seine Bemühungen bei der Planung und Durchführung des Baus und Umbaus der Maschine. Auch die Expertise und das Feedback von Dr. Bahaa Ansaf (Colorado State University-Pueblo, Dept. of Engineering) und Dr. Franziska Sandmeier (Colorado State University-Pueblo, Dept. of Biology) trugen maßgeblich zu diesem Projekt bei. Das Institute of Cannabis Research Grant an der Colorado State University-Pueblo finanzierte das größere Projekt, zu dem dieses Experiment gehörte, und ermöglichte den Kauf der Mäuse, Reagenzien und einiger der verwendeten Geräte.
Materials
| 120-Grit Sand Paper | N/A | N/A | For removal of caudal end plate soft tissues and irregularities |
| 24-bit Load Cell Interface | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | DQ-1000 | To connect load and displacement sensors to personal coputer |
| Base Mouse Diet | Dyets, Inc, Bethlehem, PA, USA | AIN-93G | Diet the mice were fed, without added hempseed |
| Diamond Cutoff Wheel w/ Rotary Tool | Dremel US, Mt. Prospect, Illinois, USA | F0130200AK | To remove vertebral proccesses |
| Displacement Sensor | Mitutoyo, Aurora, Illinois, USA | ID-S112EX | Displacement sensor with 0.001 mm resolution and 0.00305 mm accuracy |
| External Variable Voltage Power Source | Extech Instruments, Nashua, New Hampshire, USA | 382213 | To provide power to compression testing machine |
| Female C57BL/6 Mice | Charles River Laboratories, Wilmington, Massachusetts, USA | 027 (Strain Code) | Mouse model used in present study |
| Hempseed | Natera, Pitt Meadows, Canada | 670834012199 | Hempseed added to Base Mouse Diet |
| Igor Pro Software (Version 8.04) | Wave Metrics, Portland, Oregon, USA | N/A | Sofware used for load-displacement curve analysis |
| iLoad Mini Force Sensor | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | MFM-010-050-S | Load (force) sensor with 1.0% accuracy |
| Isotonic (0.9%) Saline Solution | N/A | N/A | To keep bone sampels hydrated |
| Leica EZ4 W Miscoscope | Leica Microsystems, Wetzlar, Germany | NC1601884 | For bone dissections and vertebral process removal |
| Microsoft Excel Software | Microsoft Corporation, Redmond, Washington, USA | N/A | For data transfer from SensorVue software |
| PALACOS R Bone Cement | Hareus Medical, Wehreim, Germany | 00-1112-140-01 | PMMA bone cement for embedding of the loading surface |
| Personal Computer | N/A | N/A | For data recording (see 24-bit Load Cell Interface, SensorVue Software, Microsoft Excel Software) and analysis (see Igor Pro Software) |
| SensorVue Software | LoadStar Sensors, Freemont, California, USA | N/A | Software used for real-time data collection during compression testing |
| Small Animal Dissecting Kit | N/A | N/A | Dissecting scissors, forceps, scalpel, blades, pins, gauze pads |
| Stainless Steel Top Platen (Self-Alligning) and Bottom Platen Pair | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering |
| Three-Point Bending Machine | N/A | N/A | Constructed by Colorado State University-Pueblo Dept. of Engineering. Refer to Sarper et al. (2014) for further details regarding construction |
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