들판에서 미성숙한 테프리티드 초파리를 검출하기 위해 과일 펄프를 체질합니다.

초기 및 후기 instar Anastrepha suspensa 밭에서 채취 한 과일 추출이 실험에서 우리는 발견된 유충의 비율과 이를 검출하는 데 필요한 평균 시간과 관련하여 과일 절단과 MSF(mushing, s체질, 부유) 방법을 비교했습니다. Anastrepha suspensa의 유충에 심하게 감염된 구아바는 플로리다 주 홈스테드의 열대 연구 및 교육 센터 인 플로리다 대학교 식품 농업 과학 연구소에 위치한 식물에서 수집되었습니다. 열매는 무작위로 5 개의 그룹으로 분류되어 2 가지 유충 추출 방법 중 1 가지에 할당되었습니다 : 1) 손으로 자르거나 2) MSF 방법. 각 추출방법을 이용하여 육안으로 보이는 모든 유충을 채취하는 시간을 기록하였다. 손 절단 방법은 현재 박멸 프로그램에서 사용되는 방법을 따랐습니다. 5명의 작업자(n=5) 각각에게 5개의 과일을 할당하여 과일을 더 작은 조각으로 자르고 과육을 육안으로 검사하여 유충의 모든 단계를 검색했습니다. 육안 검사에서 유충이 누락되었는지 여부를 확인하기 위해 손으로 자른 과일 조각을 해부 현미경(10x)을 사용하여 다시 검사했습니다. MSF 방법의 경우 5개의 과일을 큰 조각(50-80cm)으로 자르고 지퍼백에 넣고 껍질에서 모든 과육이 제거되고 과육이 부드러운 농도(즉, 큰 덩어리가 없음)가 될 때까지 손으로 부드럽게 짜냈습니다. 으깬 과일은 일련의 큰(45.7cm) 놋쇠 체를 통해 걸러졌습니다. 가장 큰 메쉬 (8 번)가 상단에 쌓이고 20 번과 45 번 메쉬 체가 뒤 따랐습니다. 이 처리에 배정 된 직원은 싱크대 수도꼭지에 연결된 호스의 물을 사용하여 메쉬를 통해 펄프를 세척했습니다. 늦은 instar 애벌레는 체에서 분명했다. 작은 별은 펄프와 혼합되어 보고 제거하기가 어려웠습니다. 따라서 체의 펄프/유충 혼합물을 1L의 흑설탕수 용액과 함께 양동이에 넣었습니다. 유충은 즉시 표면으로 떠올랐다. 용액을 부드럽게 교반하고, 5분 후, 유충을 버킷으로부터 제거하고, 계수하였다. 과일을 처리하는 시간은 설탕물 용액에서 유충을 썩고, 체질하고, 제거하는 조합이었습니다. 손으로 자르거나 체질하고 부양하는 방법을 통해 발견된 유충 수에 대한 데이터는 Kruskal-Wallis 비모수 검정(p = 0.05)16을 사용하여 분석되었습니다. MSF 방법은 손으로 자르는 것보다 더 많은 수의 유충(그림 2A)과 분당 더 많은 유충(그림 2B)을 산출했습니다. 이 연구에서 다른 instars의 검출이 정량화되지는 않았지만, 우리는 모든 instars (첫 번째, 두 번째 및 세 번째)가 체를 사용하여 발견 된 반면, 나중에 instars (두 번째 및 세 번째)는 손으로 절단하여 관찰되었습니다. 이전에 절단하고 육안으로 검사한 샘플을 해부 현미경 스코프로 다시 검사했을 때 과일에 감염된 후기 유충의 40%가 누락되었습니다. 그러나 초기 instars는 주로 재검사에서 발견되었습니다. 이 실험은 MSF 방법을 사용하는 것이 감염이 심한 과일에서 유충을 찾는 데 더 효과적이고 효율적이라는 것을 보여주었습니다. 그러나 적은 수의 유충에 감염된 과일은 침입 종이 매우 드문 박멸 프로그램에서 발생할 가능성이 더 큽니다. 따라서 우리는 숙주 과일이 알려진 적은 수의 유충에 감염된 실험실 연구를 수행했습니다. 낮은 Bactrocera dorsalis 감염을 시뮬레이션하기 위한 망고와 파파야의 수동 감염이 실험은 발견된 유충의 비율과 감염이 상대적으로 낮을 때 발견하는 데 필요한 시간과 관련하여 과일 절단 및 MSF 방법을 비교했습니다. 수동 감염은 존재하는 유충의 수가 확실하게 알려져 있기 때문에 각 방법의 효능을 평가하기 위한 실험 도구로 사용되었습니다. 코르크 천공충(직경 1.0cm)을 사용하여 초파리 유충이 없는 개별 망고와 파파야 과일에 5개의 구멍을 만들었습니다. 두 번째 후반에서 세 번째 초반에 한 마리의 instar B. dorsalis 유충을 과일 하위 집합의 5개 구멍 각각에 넣었습니다. 구멍은 과일에서 뚫린 조각을 사용하여 캡을 씌웠고 나머지 과일은 수동 감염을 시각적으로 시뮬레이션하기 위해 유충을 삽입하지 않고 캡을 씌웠습니다. 과일을 유충 발달을 허용하기 위해 27°C에서 48시간 동안 유지했습니다. 실험은 하와이 섬 힐로에 있는 ARS 연구소(n=5명)와 하와이 오아후 섬에 있는 APHIS-PPQ 연구소(n=4명)에서 수행되었습니다. 과일 절단을 위해 각 작업자에게 망고 5개(유충 1마리, 감염되지 않은 4개)와 파파야 4개(감염 1개, 감염되지 않은 3개)를 제공했습니다. 작업자는 각 과일을 개별적으로 더 작은 조각으로 자르고 미성숙 초파리가 있는지 펄프를 지속적으로 검사했습니다. 펄프가 철저히 검사되었을 때 검색이 중단되었습니다. 발견된 총 유충 수와 각 작업자가 절단하여 모든 과일을 처리하는 데 소요된 시간을 기록했습니다(그림 3) 및 (그림 4). 각 작업자는 머싱 또는 체질(과일 절단 없음)을 위해 또 다른 유사한 과일 세트(망고 5개와 파파야 4개)를 받았으며 앞서 설명한 대로 2개가 감염되었습니다. 펄프를 상부 체에 붓고, 프로토콜에 기재된 바와 같이, 수도꼭지로부터의 물 및 제거된 유충을 사용하여 체의 스택을 통해 세척하였다. 실험은 당 부양과 당 부화 없이 두 번 수행되어 부양 단계를 제거하면 감도를 잃지 않고 공정 속도가 증가하는지 여부를 결정했습니다(즉, 모든 또는 대부분의 유충이 발견됨)(그림 3). 발견된 유충의 수와 절단, MSF 또는 MS 방법을 통해 과일을 가공하는 데 각 작업자가 소요한 시간을 기록했습니다. 망고와 파파야 모두 전체 MSF 방법(부유 포함)이 더 많은 유충 검출 횟수를 가져왔고 과일 절단보다 빨랐습니다(표 1). 전통적인 과일 절단 방법을 사용하는 작업자는 망고와 파파야에 각각 배치된 유충의 32%와 35%를 놓쳤습니다(표 1). 국경없는의사회 기법을 사용하여 과일을 대량으로 가공하는 데 걸리는 시간은 망고를 개개로 자르는 것보다 30%, 파파야를 자르는 것보다 35% 더 짧은 시간이 소요되었습니다(그림 3). 과일 절단 방법과 비교할 때 파파야(그림 3C)와 망고(그림 3D)에 대해 MSF 방법을 사용하여 분당 더 많은 유충이 발견되었습니다. 발견 된 모든 유충은 살아있었습니다. 유충 형태학적 식별은 후기 별에서만 가능합니다. 위의 실험을 반복하되 유충의 회수율이 높게 유지되고 과실 가공 속도가 빨라졌는지를 확인하기 위해 부양 과정을 생략하였다. MS 방법(부유 생략)은 절단 및 육안 검사에 비해 파파야(그림 4A) 및 망고(그림 4B)에 대해 더 많은 유충 검출을 가져왔습니다. 또한 이 기술은 파파야(그림 4C)와 망고(그림 4D)를 절단하고 육안으로 검사하는 것보다 빨랐습니다. MSF 방법에서 부유 단계를 제거하면 파파야의 경우 90%, 망고의 경우 48% 늦게 유충을 찾는 시간이 단축되었습니다(표 2). 발견된 유충의 비율은 두 방법 모두에서 높았고 MS의 경우 일관되게 더 높았습니다(부유 생략). 파파야의 경우 유충의 80%와 85%가 각각 MSF와 MS 방법에서 회수되었습니다(표 1 및 표 2). 망고의 경우, 88%와 95%가 각각 MSF 및 MS 방법에서 회수되었다(표 1 및 표 2). 과일 절단 및 MSF 방법의 현장 비교이 실험의 목표는 현장 조건에서 과일 절단과 국경없는의사회 방법을 비교하여 비상 초파리 프로그램을 모방하는 것이었습니다. 과일 가공은 두 가지 유충 추출 방법의 현장 준비 상태를 테스트하기 위해 실험실의 편의성과 인프라 없이 수행되었습니다. 작업은 힐로 근처의 USDA-ARS 열대 식물 유전자원 및 질병 연구 부서 생식질에 위치한 구아바 과수원에서 수행되었습니다. 감염 징후를 보이는 총 40마리의 구아바를 수집하여 2개 그룹으로 나눴습니다. 총 20마리의 구아바를 절단/육안 검사에 이어 MSF(부유 포함)를 실시하여 MSF 방법과 비교하여 절단 방법의 민감도를 평가할 수 있었습니다. 해부는 전술한 바와 같이 진행되었다. 발견되면 유충을 제거하고 계산했습니다. 4 명의 작업자가 각각 5 개의 구아바를 해부하고 각 작업자에 대해 절단 및 검사에 필요한 시간을 기록했습니다. 절단 후 MSF는 더 작은 유충을 수집하기 위해 8 호 및 20 호 체 외에 세 번째 작은 메쉬 체 (No. 40, 0.420 mm)를 사용한 것을 제외하고는 위와 같이 수행되었습니다. 두 번째 구아바 20개 세트는 지퍼백(봉지당 과일 10개)에 담아 국경없는의사회만 적용(즉, 자르지 않음)하여 과일 절단에 필요한 시간과 국경없는의사회를 비교할 수 있었습니다. 위와 같이 이 절차에는 3개의 체가 사용되었습니다. 발견된 유충의 수와 과일을 처리하는 총 시간(봉지/체질/설탕 용액에 떠 있는 동안 과일을 5분 동안 머무는 것)을 기록했습니다. 실험실에서 발견된 바와 같이, 과일 절단은 과일 감염을 과소평가했으며 매우 가변적이어서 MSF 방법으로 회수할 수 있는 것보다 25%-83% 적은 유충을 검출했습니다(표 3). 또한, 유충 수가 적은 샘플에서 국경없는의사회는 500% 더 많은 유충을 회수하여 분석 민감도를 높이고 감염 유기체를 식별할 수 있는 더 큰 기회를 제공했습니다. 과일은 절단에 비해 MSF 방법을 사용하여 훨씬 빠르게 처리되었습니다. 5개의 과일을 자르고 검사하는 데는 국경없는의사회를 통해 10개의 과일을 가공하는 것과 거의 같은 시간이 필요했습니다. 그림 1: 초파리 유충 추출 프로토콜의 단계. (A) 한 번에 약 2L의 과일을 처리합니다(예: 구아바 5개 또는 중간 망고 5개가 이 방법에 적합한 샘플을 구성함). (B) 과일을 큰 조각으로 자르고 4L 지퍼 잠금 장치 보관 가방에 넣습니다. (C) 물이 다진 과일을 25-50mm 덮을 때까지 백에 물을 추가합니다. (D) 모든 과육이 껍질에서 제거되고 부드러운 농도(즉, 큰 덩어리가 없음)가 될 때까지 손으로 과일을 부드럽게 짜냅니다. (E) 큰 메쉬(8번, 2.36mm) 체와 함께 체를 쌓고 그 위에 작은 메쉬(20번, 0.85mm) 체를 쌓습니다. 초기 instars의 경우 스택 바닥에 세 번째 체 (No. 45, 0.35mm)를 놓습니다. (F) 펄프를 상단 체에 붓습니다. (G) 미세한 펄프가 첫 번째 체를 통과할 때까지 수도꼭지, 호스 또는 병의 물을 사용하여 체 더미를 통해 펄프를 철저히 씻습니다. (H) 껍질이나 큰 과일 조각과 함께 남아 있을 수 있는 후기 유충이 있는지 상단 체를 육안으로 스캔합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2 : 초기 및 후기 instar Anastrepha suspensa 추출물 밭에서 수집 한 과일. 구아바 열매 5개에서 추출한 Anastrepha suspensa 유충의 평균 수±(평균[SE]의 표준 오차)는 절단 및 육안 검사(절단: 70.4 ± 11.9)하거나 일련의 3개의 체를 통해 펄프를 세척한 다음 펄프를 설탕물 용액(MSF: 175.6 ± 21.91)(A)에 담궈 채취한 것입니다. 절단 (1.21 ± 0.16) 및 MSF (3.71 ± 0.50)에 의해 처리 된 5 개의 구아바에서 분당 수집 된 평균 유충 수 (±SE). 각 방법은 5회 복제되었으며, 막대 위의 별표는 Kruskal-Wallis 테스트를 기반으로 한 유충 수(χ2 = 6.81, p < 0.01)와 처리 시간(χ2 = 6.80, p < 0.01)에 대해 유의미한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 낮은 Bactrocera dorsalis 감염을 시뮬레이션하기 위해 망고와 파파야의 수동 감염을 사용한 전체 mushing-sieving-floatation 방법의 검증. (A) 및 망고(절단: 3.4 ± 0.51, MSF: 4.4 ± 0.4)에서 발견되는 Bactrocera dorsalis 유충(±SE)의 평균 수(절단: 0.±51 MSF: 4.4± 0.4) (B) 과실과 파파야(절단: 0.21± 0.1, MSF: 0.4± 0.15)에서 발견된 평균 유충수(±SE)와 망고(절단: 0.14± 0.01, MSF: 0.21± 0.03)(D). 절단 또는 MSF 방법(부양 포함, n = 5)을 사용하여 가공된 과일은 5마리의 세 번째 유충으로 수동으로 감염되었습니다. 막대 위의 별표는 Kruskal-Wallis 테스트를 기반으로 한 과일 절단과 비교할 때 파파야(χ 2 = 5.39, p = 0.02)와 망고(χ2 = 3.94, p = 0.05)에서 발견되는 유충 수에 대해 상당한 차이를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 낮은 Bactrocera dorsalis 감염을 시뮬레이션하기 위해 망고와 파파야의 수동 감염을 사용한 mushing-sieving 방법(부유 제거)의 검증. 파파야에서 발견되는 평균 유충 수(±SE)는 파파야(절단: 0.48±, MS: 4.25± 0.48)(A) 및 망고(절단: 2.5± 0.5, MS: 4.75± 0.25)(B) 과실에서 발견된 평균 유충 수(±SE)와 파파야(절단: 0.15± 0.05, MS: 0.76± 0.15)(C) 및 망고(절단: 0.16± 0.04, MS: 0.44± 0.04)(D). 열매는 5 개의 제 3 instar Bactrocera dorsalis 유충으로 수동으로 감염되고 절단 및 육안 검사 (절단)에 의해 처리되거나 봉지에 담겨 체로 세척되었습니다 (부양 없이 분출 및 체질만, n = 4). 막대 위의 별표는 파파야에서 발견되는 유충의 수에 대한 유의미한 차이를 나타냅니다 (χ 2 = 5.46, p = 0.02) 및 망고 (χ 2 = 5.25, p = 0.02) 파파야 처리 시간 (χ 2 = 5.39, p = 0.02) Kruskal-Wallis 테스트를 기반으로 과일 절단과 비교했습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 과일 # 과일 가공 #Larvae 추가되었습니다 처리 방법 #Larvae 찾았습니다. 처리 시간(분)* % 회복 망고 25 25 절단 17 158 68% 망고 25 25 국경없는의사회 22 113 88% 파파야 16 20 절단 13 62 65% 파파야 16 20 국경없는의사회 16 40 80% *총 시간은 5명 이상의 근로자를 합산했습니다. 표 1: 회수된 유충의 수와 절단 및 육안 검사(절단) 또는 전체 분쇄, 체질 및 부유(MSF) 방법에 의한 과일 처리 시간. 테스트 과일은 지루하고 뚜껑이 있는 과일(망고 5개 중 1개, 파파야 4개 중 1개)과 혼합된 5개의 세 번째 인스타 유충으로 수동으로 감염되었습니다. 과일 # 과일 가공 #Larvae 추가되었습니다 처리 방법 #Larvae 찾았습니다. 처리 시간(분)* % 회복 망고 20 20 절단 10 66 50% 망고 20 20 미시시피 19 44 95% 파파야 16 20 절단 5 38 25% 파파야 16 20 미시시피 17 25 85% *총 시간은 4명 이상입니다. 표 2: 회수된 유충의 수와 절단 또는 분쇄 및 체질만으로 과일을 처리하는 시간, 부유 생략(MS). 테스트 과일은 지루하고 뚜껑이 있는 과일(망고 5개 중 1개, 파파야 4개 중 1개)과 혼합된 5개의 세 번째 인스타 유충으로 수동으로 감염되었습니다. 작업자/방법 처리#Fruit 처리 시간(분) #Larvae 절단을 발견했습니다. #Larvae MSF * 발견 절단을 통해 발견된 전체 유충의 % 작업자 1 : 절단 5 18 33 14 70% 작업자 2 : 절단 5 18 1 5 17% 작업자 3 : 절단 5 26 9 11** 75% 작업자 4 : 절단 5 20 24 노동자 5: 국경없는의사회 10 22 해당 없음 22 해당 없음 노동자 6: 국경없는의사회 10 18 해당 없음 37 해당 없음 * 절단 및 육안 검사에서 펄프는 MSF 방법을 사용하여 다시 처리하여 놓친 후기2-3 번째 instar 유충의 수를 결정합니다 ** MSF 방법을 사용하여 가공하기 전에 풀링된 작업자 2 및 3 과일의 펄프 표 3: 열매를 절단하고 육안으로 검사(절단) 또는 열매를 으르렁거리고, 체질하고, 떠다니는(MSF) 통해 현장에서 채취한 구아바에서 발견된 유충의 수.