体外研究 胎儿人体血管芯片模型研究发育机械生物学

注意：所有细胞培养技术必须在无菌条件下在层流罩中进行，并且细胞必须在37°C下在含有5%CO2的腐殖化气氛中孵育。所有用于维持的细胞因子制备 （rhbFGF） 和分化方案（rhBMP4、rhVEGF、rhbFGF、rhIL6、rhFLT3L、rhIGF1、rhIL11、rhSCF、rhEPO、rhTPO、rhIL3）的说明见 补充表 S1。 1. hiPSC的培养 – 细胞的解冻、维持和冷冻 制备维持培养基、生长因子和其他试剂通过将全 hESC 无血清培养基补充剂、36 mL 25% 牛血清白蛋白 （BSA） 和 1 mL 55 mM β-巯基乙醇加入 Dulbecco 改良的 Eagle 培养基/F12 （DMEM/F-12） 基础培养基中来制备培养基（参见 材料表）。 将 1mgRho激酶抑制剂 （iRock）重悬于1mL DMSO中，制备50μL的等分试样，并将其储存在-20°C。注意：这些等分试样可以在-20°C下保存1年。解冻后，它们可以在4°C下保存1周。 在-80°C储存之前，在冰上解冻玻连蛋白（VTN-N）溶液，每瓶分装60μL。 在涂覆板之前，将 60 μL 原液稀释在 6 mL Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 中;终浓度为5μg/mL。 hiPSC细胞系解冻注：人类多能干细胞系SFCi55以前是内部衍生的，广泛用于分化成各种细胞类型和不同的胚胎谱系19,20,21,22。在37°C下用1mL VTN-N溶液包被6孔板的一个孔1小时。注：孵育后，包被的板可以在4°C下储存长达1周。 用吸液管吸出VTN-N溶液，加入1mL补充有20ng / mL rhbFGF的预热培养基（补充表S1）。 在水浴中快速解冻含有hiPSC的小瓶，并将细胞转移到5mL预热的培养基中。 在室温下以300× g 旋转细胞3分钟。 将细胞沉淀重悬于补充有 20 ng/mL rhbFGF 的 0.5 mL 培养基中。 将细胞转移到一个已经含有 1 mL 培养基的包被孔中。 在总共 1.5 mL 培养基中将 5 μL iRock 加入含有细胞的孔中。 在培养箱中培养细胞，在一周内每天更换培养基，并加倍喂养细胞，向细胞中加入两倍于正常体积的培养基，以确保周末喂养。注意：细胞仅在iRock存在下生长24小时。 hiPSC的维持和传代每天用补充有 20 ng/mL rhbFGF 的新鲜预热培养基更换培养基。 当细胞达到大约 80% 的汇合度时，通常每周两次。为了传代细胞，如前面步骤1.2.1和1.2.2所述，用VTN-N包被板。 从带有细胞的孔中吸出培养基，并用DPBS洗涤。 吸出DPBS，加入1mL解离试剂（参见 材料表）并孵育1分钟。 吸出解离试剂并再孵育 3 分钟。用力敲击每侧板 10 次。注：解离步骤可能需要在孵育时间和敲击程序中进行细胞类型特异性优化。 向细胞中加入 1 mL 培养基，并用巴斯德移液管，用培养基洗涤一次，以确保收集大部分菌落。 向每个孔中加入 150 μL 细胞悬液，以提供 1 孔到 6 孔的传代比。注意：解冻新小瓶后，最好立即以较低的比例（例如 1：1 或 1：2）传代细胞一次或两次传代，以使它们在以 1：6 的比例传代之前达到稳定的生长阶段。 在培养箱中培养细胞，在一周内每天更换培养基，并在周末对细胞进行两次补料。 hiPSCs细胞系冷冻注意：在解冻后的前两次传代中冷冻细胞，以确保保持恒定的低传代批次冷冻小瓶以开始培养。当细胞达到约80%的汇合度时，冷冻细胞。将培养基更换为补充有 20 ng/mL rhbFGF 和 5 μL iRock 的新鲜预热培养基，并孵育至少 1 小时。 按照步骤 1.3.2.2-1.3.2.5 中的说明分离细胞。 将分离的细胞收集在含有 5 mL 培养基的 15 mL 离心管中。 在室温下以300× g 离心3分钟。 吸出上清液并加入 1 mL 冻存溶液（参见 材料表）。 使用巴斯德移液管，轻轻地上下移液细胞，将它们混合在冻存溶液中。注意：避免过度移液，这可能会导致细胞簇解离。 将细胞悬液分成两个冻存小瓶，每个小瓶 0.5 mL。 将冻存小瓶转移到预冷于4°C的冻存容器中。 将装有细胞的容器转移到-80°C冰箱中24小时，然后将小瓶转移到液氮中进行长期储存。 2. hiPSCs分化为内皮细胞 分化培养基、细胞因子和生长因子的制备根据 表1制备无血清分化培养基（SFD）。从分化第 0 天到第 5 天使用该培养基。 通过向 34 SFM 基础培养基中加入 34 种营养补充剂和 5 mL L-谷氨酰胺补充剂，制备用于 CD34+ 细胞 （SFM-34） 的无血清培养基（参见 材料表）。从分化第 6 天开始使用这种培养基。 将 1 mg CHIR99021重悬于 716 μL DMSO 中，以获得 3 mM 溶液。在室温下孵育直至完全重悬;如果需要，在37°C下快速预热。 制备20μL等分试样，并在-20°C下储存长达6个月。解冻后立即使用，不要再次冷冻或储存。 根据 补充表S1中的说明重悬细胞因子。将所有细胞因子的等分试样储存在-80°C。 内皮细胞分化注：对于分化的每一天，根据中描述的细胞因子混合物制备 18 mL（3 mL 培养基/孔）预热的 SFD 培养基 表2.第 0 天 – 胚状体 （EB） 的形成为每个 6 孔板（3 mL/孔）制备 18 mL SFD 培养基，根据 表 2 混合 1 细胞因子。 在细胞驱避剂 6 孔板的每个孔中加入 2 mL 预热的 SFD 培养基，其中混合 1 细胞因子（参见 材料表）。 要形成 EB，请按照步骤 1.3.2.2-1.3.2.4 中描述的步骤操作。注意：确保 hiPSC 达到 70-80% 的汇合度以开始分化。 将 1 mL 预热的 SFD 培养基与混合 1 细胞因子添加到分离细胞簇的每个孔中。 使用巴斯德移液管以1：1的比例轻轻地将细胞簇转移到细胞驱避孔的单孔中，以形成EB。 将板放入培养箱后，向前和向后、左右移动，使EB均匀地分散在孔中。 第 1 天 – EB 的中等变化注意：只有在分化第 1 天，有许多单细胞与 EB 一起悬浮时，才需要此步骤。为每个 6 孔板（3 mL/孔）制备 18 mL SFD 培养基，根据 表 2 混合 1 细胞因子。 用 EB 旋转板以将它们移动到中心，并使用巴斯德移液管将它们收集到 15 mL 离心管中。注意：如果 EB 看起来像成串一样聚集在一起，请在将它们收集到 15 mL 离心管中之前，用 P1000 上下移液将它们分开。 等待 5-10 分钟，让 EB 沉淀在管底部。注意：如果EB太小，则以100× g 离心5分钟以帮助它们沉淀。 用无菌水或DPBS清洗细胞驱避板，以去除任何单个细胞或碎片。 小心缓慢地从EB中吸出上清液，不要将其移出。 将 2 mL 含有混合 1 细胞因子的 SFD 添加到细胞驱避板的每个孔中。 使用 1 mL SFD 培养基重悬 EB，每个起始孔混合 1 种细胞因子 – 对于 6 孔板，加入 6 mL 培养基。 将EB以每孔1 mL体积转移到细胞排斥板上，其中已经含有2 mL SFD培养基。 将板放入培养箱后，向前和向后、左右移动，使EB均匀地分散在孔中。 第 2 天 – 添加CHIR99021将EB旋转到板的中心，并根据 孔的侧面根据表2 添加CHIR99021以避免与细胞直接接触。注意：如果在第 1 天未更换培养基，请更换整个培养基，而不是单独添加 CHIR。根据 表 2 制备 18 mL SFD 培养基，用于每个 6 孔板（3 mL/孔）。 将板放入培养箱后，向前和向后、左右移动，使EB均匀地分散在孔中。 第 3 天 – 培养基改变 EB 并添加 Mix 3 细胞因子为每个 6 孔板（3 mL/孔）制备 18 mL SFD 培养基，根据 表 2 混合 3 种细胞因子。 按照步骤 2.2.2.2-2.2.2.4 中所述收集 EB。 将预热的 2 mL 含有混合 3 种细胞因子的 SFD 培养基加入细胞驱避板中。 小心地从EB中吸出上清液。加入 1 mL/孔的 SFD，混合 3 种细胞因子。 按照步骤 2.2.2.8-2.2.2.9 中所述在孔之间分配 EB。 第 6 天 – SFM-34 培养基变化和添加 Mix 4 细胞因子为每个 6 孔板（3 mL/孔）制备 18 mL SFD 培养基，根据 表 2 混合 4 种细胞因子。 按照步骤 2.2.2.2-2.2.2.4 中所述收集 EB。 将 2 mL 预热的 SFM-34 培养基与混合 4 种细胞因子添加到细胞驱避板中。 小心地从EB中吸出上清液。加入 1 mL/孔的 SFM-34 和混合 4 种细胞因子。 按照步骤 2.2.2.8-2.2.2.9 中所述在孔之间分配 EB。 3. CD34+ 细胞分离并接种到芯片中 注：CD34 + 细胞通过CD34微珠试剂盒（参见 材料表）的阳性分离方法分离，该试剂盒含有与单克隆小鼠抗体抗人CD34抗体和FcR阻断试剂（人IgG）偶联的CD34微珠。通过在分离前后对细胞进行染色来验证柱分离的效率以进行流式细胞术分析非常重要，下面指示了何时需要采集细胞进行此分析。 准备材料和试剂。通过加入 5 mL 5% BSA 溶液和 200 μL EDTA 0.5 M 至 45 mL DPBS 制备洗涤缓冲液，以获得 PBS + 0.5% BSA + 2 mM EDTA。每次分离时准备新鲜的，过滤灭菌，并在使用前保持冷藏。 用层粘连蛋白溶液涂覆流体芯片，该溶液通过在DPBS Ca2 + Mg2+中稀释rhLaminin 521 1：50制备。用适合正在使用的芯片的体积涂覆每个芯片，并在接种前在培养箱中孵育2小时。注意：其他基质可用于包被，并应针对特定的细胞类型/实验进行测试。 根据 表2 ，通过补充18mL SFM-34培养基和Mix 4细胞因子来制备Mix 4 SFM-34培养基，并将混合物放入培养箱中的50mL管中，盖子稍微拧开以利于气体交换。 将选定的灌注装置和任何其他要使用的管道放入培养箱中进行脱气。 第 8 天 – EB 解离和 CD34+ 分离按照步骤 2.2.2.2-2.2.2.5 中的说明收集 EB。 每个收集的 EB 起始孔添加 1 mL 细胞解离试剂（如果收集了 6 个孔，则添加 6 mL）。 将细胞解离试剂中的 1 mL EB 悬浮液转移回细胞驱避板的每个孔中。 在培养箱中孵育10分钟。 用 P1000 轻轻地将 EB 上下移液到孔中，不超过 10 次。 重复步骤 3.2.4-3.2.5.总共 3 次。注意：如果 EB 难以解离，请重复上述步骤总共 4 次。 为解离的 EB 的每个孔添加 5 mL 洗涤缓冲液。 通过将细胞通过 40 μm 过滤器，将细胞收集到 50 mL 离心管中。取 10 μL 细胞悬液对细胞进行计数。注：为了测试分离效率，将 10 个5 个 细胞/管转移到两个不同的试管（未染色的对照和预分拣的测试样品）中，稍后将用于流式细胞术（如步骤 4.3.9-4.3.13 中所述）。对于 6 孔板，过滤后应收集 ~106 个细胞。 将细胞以300× g旋转10分钟。 将细胞重悬于 300 μL 洗涤缓冲液中，轻轻移液几次以确保不存在团块。继续遵循制造商的协议（参见 材料表）。 将 CD34+ 细胞接种到流控芯片中注：协议中使用的流体芯片的通道高度为0.6 mm，长度为50 mm，总生长面积为2.5 cm2 （补充图S1）。这种类型的芯片接种总体积为150μL的细胞悬液，可以使用不同的芯片，接种量和细胞密度应根据生长区域进行调整。根据所使用的细胞系及其生长情况，可能需要进行额外的优化。将分离的 CD34+ 细胞重悬于 300 μL 预热的含有 4 种细胞因子的预热 SFM-34 培养基中。 取 10 μL 细胞悬液并计数细胞。 重悬 2.5 × 105 个细胞，最终体积为 150 μL 补充的 SFM-34;加入 0.5 μL iRock。注：为了测试分离的效率，将 10 个5 个 细胞/管转移到稍后将用于流式细胞术的试管（分选后的测试样品）中（如步骤 4.3.9-4.3.13 中所述）。 通过将 P200 的尖端放入通道边缘的储液罐内，从流体芯片中缓慢吸出层粘连蛋白。注意： 如果液体难以收集，请慢慢提起芯片的一侧，以帮助液体移动到对面的储液罐。 将细胞悬液稳定地加入通道中，以确保没有形成气泡。注意： 快速但轻柔地执行步骤 3.3.4-3.3.5，以避免层粘连蛋白变干并在芯片通道中形成气泡。如果形成气泡，提起芯片的一侧并轻轻敲击载玻片以调动气泡;当它们到达水库时，它们将上升到空气接口，并且应该无法进入通道。 将芯片转移到培养箱中并放置过夜，使细胞完全附着在通道上并看起来细长。 当细胞完全附着时，如步骤3.3.4所示吸出培养基，并用200μL补充细胞因子的SFM-34代替。 从现在开始，每天更换培养基，直到细胞达到 90%-100% 汇合度。 4. 连续流动在内皮细胞中的应用 – Aorta-on-a-chip 准备材料和试剂。根据 表2 ，用Mix 4细胞因子补充18mL SFM-34培养基，制备Mix 4 SFM-34培养基，并将其置于培养箱中的50mL管中，盖子稍微拧开以利于气体交换。 将选定的灌注装置和任何用于流体设置的管道放入培养箱中进行脱气。 流体系统总成根据制造商的协议将灌注装置安装到设备中。注意： 请记住使用夹子amps 在系统中。如果此步骤使用滑动夹具，则需要在连接到芯片之前在管道上滑动。 连接新的流控芯片并添加补充细胞因子的 SFM-34 培养基，确保在无菌条件下在通风橱中填充两个储液槽。 执行气泡去除程序和校准步骤。 从培养箱中取出带有连接装置的流体单元并将其转移到罩中;从培养箱中取出含有细胞的芯片。 夹紧测试芯片两侧的管子。 从测试芯片上取下管子。注意： 检查管道末端的鲁尔接头中是否存在气泡。如果可见气泡，请使用 P200 移液器小心地吸出它们，如有必要，添加更多培养基以确保连接器充满培养基。 将包含细胞的芯片与管道连接。 取下或打开 clamps。 将系统转移到培养箱，并将气泵连接到流体单元。 使用泵专用软件（补充图S2）启动预选程序，并逐渐增加 表3中描述的剪切应力。注意：根据所需的特定实验，刺激程序可能需要优化。这里描述的是剪切应力逐渐增加，导致最终值为 5 dyn/cm2，它模拟了在胎儿循环开始时计算出的背主动脉壁所经历的剪切应力 9。与将采用的最终剪切应力无关，有必要随着时间的推移逐渐增加，以使电池适应力，而不会导致电池与芯片分离。如果选择的刺激方案超过 3 天，则应通过添加 1 mL 含有 Mix 4 细胞因子的 SFM-34 将细胞因子补充到系统中，这些细胞因子通常添加到 18 mL 中。为此，泵程序被迅速暂停，并将 500 μL 补充的培养基添加到流体装置中的两个注射器中的每一个。 用于分析的细胞采集在水浴中预热解离缓冲液。 从培养箱中取出流体单元并将其移入罩中。 夹紧两侧芯片两侧的管路，然后从芯片上的储液槽中取出管路。 轻轻地从芯片中取出培养基，并用DPBS Ca 2+ Mg2+代替以洗涤细胞。注意：如果细胞开始分离，可以跳过用PBS洗涤的这一步骤。 轻轻加入150μL解离缓冲液，并在37°C下孵育3分钟。注意：在显微镜下检查细胞是否是单个和分离的;否则，再孵育 2 分钟。在吸出培养基之前，必须将细胞从通道中完全分离，因为芯片不允许通过移液来帮助细胞分离。可以使用其他溶液来分离细胞，例如胰蛋白酶或基于EDTA的缓冲液。 从一个储液器中收集含有细胞的解离缓冲液，然后转移到15mL离心管中，并用DPBS洗涤通道一次以收集所有分离的细胞。 将 1 mL 洗涤缓冲液加入装有细胞的 15 mL 试管中，并取 10 μL 对细胞进行计数。 将流式细胞术管中的细胞悬液分开，使每个试管有105 个细胞。 以300 ×g旋转试管5分钟。 准备染色溶液，使每个试管有50μL进行染色。分别以 1：100 和 1：200 稀释度加入 CD34 PerCP-efluor710 或 CD34-PE。 将细胞重悬于50μL染色溶液中，并在4°C下孵育30分钟。 通过加入 2 mL 洗涤缓冲液洗涤细胞并以 300 × g 离心 5 分钟。 将沉淀重悬于100μL染色溶液中，并使用流式细胞仪获取数据。注：细胞也可以直接在芯片中使用 150 μL RNA 裂解缓冲液进行 RNA 提取，或在室温下使用 DPBS 中的 4% 多聚甲醛固定成像 10 分钟。 细胞取向分析使用FIJI23 （补充图S3）分析图像以量化细胞取向的变化。从“分析”|”工具 |ROI 管理器菜单。 使用 多边形选择工具 手动绘制单元格轮廓，并通过单击 “添加 ”或使用 CTRL+T 快捷方式将其添加到 ROI 管理器中。 通过在 “分析”|”设置“测量 ”菜单。 通过“更多”将测量应用于所有 ROI … ROI 管理器中的 Multi measure 命令。注意：此步骤将为每个 ROI 拟合一个椭圆，并生成一个包含长椭圆轴和短椭圆轴的长度以及角度的表格。 将表格导出为 CSV 文件，以导入到其他软件中进行绘图。注意：用于绘图的脚本可在 https://gist.github.com/nicolaromano/708b3231d730ee7f70763a7cf8850ddc。