狂犬病間接蛍光抗体検査を用いた狂犬病IgGおよびIgM抗体の検出
Summary
この原稿の目的は、狂犬病特異的IgGおよびIgM抗体を検出するための狂犬病間接蛍光抗体検査の使用を検討することです。
Abstract
狂犬病間接蛍光抗体(IFA)検査は、血清または脳脊髄液中のさまざまな狂犬病特異的抗体アイソタイプを検出するために開発されました。この検査は迅速な結果を提供し、いくつかの異なるシナリオで狂犬病抗体を検出するために使用できます。狂犬病IFA検査は、狂犬病を発症した患者の免疫反応を評価するための抗体の迅速かつ早期検出に特に役立ちます。生前の狂犬病診断には他の方法が優先されますが、この検査は、抗体検出を通じて最近の狂犬病ウイルスへの曝露を実証するために利用される場合があります。IFA検査では、ウイルス中和抗体(VNA)力価は得られませんが、曝露前予防(PrEP)反応は、抗体の陽性または陰性の存在によって評価できます。このテストはさまざまな状況で利用でき、さまざまなターゲットに対して結果を提供できます。この研究では、PrEPを投与された個人から採取したいくつかのペアの血清サンプルを使用し、IFAテストを使用して狂犬病抗体の存在を経時的に実証しました。
Introduction
狂犬病間接蛍光抗体(IFA)検査は、血清または脳脊髄液中のさまざまな狂犬病特異的抗体アイソタイプを検出するために使用されます。これは、生前の狂犬病患者を監視するために利用できる検査の武器庫の1つです。特に、狂犬病感染に対する患者の免疫反応を評価する抗体の早期発見に有用です。IFA検査は、他の検査、病歴、患者のワクチン接種状況と併用することで、狂犬病ウイルスやワクチンへの曝露を判断するのに役立ちます1。IFA検査はIgMおよび/またはIgGを測定するため、特異的抗体の値は、抗原1への曝露からのおおよその時間枠を示すことができます。このテストは、リストされているアプリケーションや、まだ検討されていない他のアプリケーションで役立つ場合があります。
狂犬病血清学的アッセイはいくつかあります。狂犬病ウイルス中和抗体(RVNA)を測定する主な方法は、迅速蛍光焦点阻害試験(RFFIT)、蛍光抗体ウイルス中和試験(FAVN)、またはこれらの修飾です1。ただし、これらの検査では、IgM抗体とIgG抗体は区別されません。狂犬病免疫応答のモニタリングにおいて抗体アイソタイプの鑑別が重要な場合、狂犬病IFAおよび狂犬病酵素結合免疫吸着測定法(ELISA)試験が使用されますが、RVNAは測定されません。IFA検査とELISA検査は、検体中の狂犬病特異的抗体の存在を判定するために使用できますが、その実行方法にはいくつかの違いがあります。IFA検査では、細胞培養された生きたウイルスを抗原基質として利用しますが、狂犬病検出用の一般的なELISAでは、1つ以上のウイルスタンパク質を使用します。狂犬病ウイルスを培養できる実験室では、ELISA用の個々のウイルスタンパク質を購入または培養する代わりに、IFA検査をより簡単に実施できる可能性があります。検査の目的と狂犬病血清学的アッセイの結果から得られた情報は、どちらを選択するかを決定する際に考慮する必要があります2。
IgMが最初に反応し、28日目頃にクラス切り替えが観察されるまで増加し、その時点でIgGが主要な循環抗体になります3。したがって、IgMは、狂犬病ウイルスへの曝露またはワクチン接種後の限られた時間のみ予想されます。血清と脳脊髄液(CSF)の両方を検査することで、曝露がワクチン接種によるものか(抗体は血清にのみ見られる)、またはウイルス感染によるものか(CSF1に抗体を示す可能性がある)を示すことができます。
狂犬病抗体は曝露前予防(PrEP)後数年間持続することが確立されています4。IFA検査は、ワクチン接種後や曝露後のさまざまな時点でこれを実証するための有用なツールとなり得ます。
Protocol
Representative Results
Discussion
IFA検査では、抗原抗体複合体を利用することで、狂犬病特異的抗体を可視化する標識部位が可能になります。神経芽細胞腫またはBHK細胞をマルチウェルPTFEコーティング顕微鏡スライドに播種し、狂犬病ウイルスラボ株CVS-11を接種します。単分子膜がコンフルエントになり、細胞が約50%の所望の感染力に達すると、スライドは使用準備が整うまで保存されます6。
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
このプロジェクトを支援してくださったニューヨーク州保健省ワズワースセンターに感謝します。
Materials
| 25x55mm glass cover slips | Any | ||
| Acetone | Any | ||
| Anti-Human IgG Labeled Conjugate | Sigma-Aldrich | F9512 | |
| Anti-Human IgM Labeled Conjugate | SeraCare | 5230-0286 | |
| Aspirating pipette tip | Any | ||
| BHK-21 Cells | ATCC | CCL-10 | |
| BION IFA Diluent | MBL BION | DIL-9993 | |
| Cell Culture water | Sigma-Aldrich | W3500 | EGM |
| Coplin Jars | Any | ||
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F2442 | EGM |
| Fluorescent microscope with FITC filter | Any | ||
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G7893 | Mountant |
| Gullsorb IgM inactivation reagent | Fisher Scientific | 23-043-158 | IgG Inactivation Reagent |
| L-Glutamine | Sigma-Aldrich | G-7513 | EGM |
| Minimum Essential Media Eagle – w/Earle’s salts, L-glutamine, and non-essential amino acids, w/o sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | M0643 | EGM |
| Mouse Neuroblastoma Cells | ATCC | CCL-131 | |
| Multi-well Teflon coating glass slides | Any | ||
| PBS | Any | pH 7.6 | |
| Penicillin | Sigma | P-3032 | EGM |
| Rabies Direct Fluorescent Antibody Conjugate | Millipore Sigma | 5100, 5500 or 6500 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S-5761 | EGM |
| Sodium Chloride crystals | Sigma-Aldrich | S5886 | Mountant |
| Sterile dropper | Any | ||
| Streptomycin sulfate salt | Sigma | S9137 | EGM |
| Trizma pre-set crystals pH 9.0 | Sigma-Aldrich | S9693 | Mountant |
| Tryptose Phosphate Broth | BD | 260300 | EGM |
| Vitamin mix | Sigma-Aldrich | M6895 | EGM |
Referencias
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