Análise Automatizada Otimizada da Modulação da Homeostase das Mitocôndrias Neuronais Vivas por Receptores de Ácido Retinóico Isoform-Específicos

As mitocôndrias celulares estão no centro de todos os estados fisiológicos, e uma compreensão completa de sua homeostase (mitostase) e comportamento é fundamental para auxiliar na identificação do tratamento farmacológico para uma ampla gama de doenças, incluindo câncer e doença de Alzheimer ^1,2.

As mitocôndrias desempenham papéis celulares cruciais na homeostase energética, geração de ATP, tamponamento de cálcio e regulação de EROs, e a mitostase é essencial para manter a homeostase proteica, uma vez que as chaperonas moleculares são dependentes de energia³. Estes requerem uma modulação e adaptação de rede constante e dinâmica para atender eficientemente às necessidades celulares, e o transporte mitocondrial é regulado por diferentes vias de sinalização; trabalhos anteriores descreveram uma dessas vias, a dos receptores do ácido retinóico (RARs)^4,5. O ácido retinóico (AR) promove crescimento axonal e neurítico via ativação RAR. Em neurônios corticais primários de camundongos, a ativação do RAR-β estimula o crescimento, a velocidade e a mobilidade mitocondrial no neurito⁶.

Considerando a adaptabilidade e dinâmica da rede mitocondrial, a possibilidade de avaliar a mitostase em “tempo real” é essencial não apenas para investigar a homeostase energética, mas também para proteostase, saúde celular, proliferação ou sinalização. Um método comumente utilizado para avaliação de mitostases baseia-se na microscopia confocal após o realce mitocondrial usando um corante ou marcador fluorescente, bem como uma configuração de microscopia específica que permite a regulação da temperatura e/ou do CO₂ ⁷. Esse tipo de arranjo experimental implica que uma réplica experimental seja realizada de cada vez. Além da repetição experimental de diferentes tratamentos, deve-se considerar que a maioria dos experimentos deve ter suas réplicas técnicas (onde mais de uma posição é imageada por placa), com uma série de planos focais (z-stacks) sendo registrados em uma série de pontos de tempo. Assim, um delineamento experimental com três repetições de um controle e dois tratamentos, com cinco posições de imagem por placa, e 15 pontos de tempo, resultou em 225 pilhas a serem processadas. Classicamente, os vídeos de mitocôndrias vivas eram analisados por meio de quimografias plotadas, que seriam analisadas^{individualmente8}, em um processo demorado que exigia extensa entrada manual, mesmo quando dependia de ferramentas computacionais.

Recentemente foi descrito^{um algoritmo 9} que permite segmentação e rastreamento automatizado de mitocôndrias em arquivos time-lapse 2-D e 3-D de células vivas. Outras técnicas de quantificação estão disponíveis e todas apresentam suas limitações¹⁰. O mitômetro, um aplicativo automatizado de código aberto, é particularmente adequado para análise de lapso de tempo e dinâmica mitocondrial, exigindo baixa entrada do usuário. Esta aplicação tem uma série de vantagens sobre outras ferramentas existentes baseadas no MATLAB, nomeadamente permitindo o processamento automático de pilhas TIF individuais, utilizando até 13 parâmetros diferentes, particularmente interessantes para as neurociências, uma vez que diferencia entre mitocôndrias peri e telenucleares.

No entanto, para um experimento como o descrito acima, esses 13 parâmetros aplicados a 225 pilhas resultam em 2.925 arquivos de saída individuais. Estes requerem quatro entradas de computador individuais, que somam mais de 10.000 entradas manuais sendo necessárias para baixar todos os arquivos de saída. Para grandes projetos experimentais, isso resulta em uma análise desnecessariamente extremamente demorada de cada arquivo e integração de dados. Aqui apresentamos uma rotina de otimização que permite a análise rápida de arquivos, reduzindo consideravelmente a leitura de documentos e o processamento de dados, analisando os dados de forma definida, consistente com a saída das ferramentas existentes.