동형 특이적 레티노산 수용체에 의한 살아있는 신경 미토콘드리아 항상성 조절의 최적화된 자동 분석
Summary
미토콘드리아 네트워크는 매우 복잡하여 분석하기가 매우 어렵습니다. 새로운 MATLAB 툴은 타임랩스 이미지에서 실시간 컨포칼 이미징 미토콘드리아를 분석하지만, 출력 볼륨이 커서 개별 수동 주의가 필요합니다. 이 문제를 해결하기 위해 신속한 파일 분석이 가능한 루틴 최적화가 개발되었습니다.
Abstract
복잡한 미토콘드리아 네트워크는 살아있는 세포를 분할, 추적 및 분석하는 것을 매우 어렵게 만듭니다. MATLAB 툴을 사용하면 타임랩스 파일의 미토콘드리아를 분석할 수 있어 이미지 처리 프로세스가 상당히 간소화되고 속도가 빨라집니다. 그럼에도 불구하고 기존 도구는 많은 양의 출력을 생성하므로 개별적인 수동 주의가 필요하며, 기본 실험 설정에는 수천 개의 파일이 출력되어 각각 광범위하고 시간이 많이 소요되는 처리가 필요합니다.
이러한 문제를 해결하기 위해 MATLAB 코드 및 라이브 스크립트 형식 모두에서 루틴 최적화가 개발되어 신속한 파일 분석이 가능하고 문서 읽기 및 데이터 처리가 크게 줄었습니다. 100개 파일/분의 속도로 최적화를 통해 전반적으로 빠른 분석이 가능합니다. 최적화는 시간 프레임 전반에 걸쳐 개별 미토콘드리아에 대한 프레임별 데이터의 평균을 구하고 기존 도구의 출력과 일치하는 정의된 방식으로 데이터를 분석하여 결과 출력을 달성합니다. 염료 테트라메틸로다민 메틸 에스테르를 사용하여 실시간 공초점 이미징을 수행했으며, 신경 세포 미토콘드리아에 대한 효과가 문헌에 확립된 레티노산 수용체(RAR) 작용제로 신경 세포를 처리하여 일상적인 최적화를 검증했습니다. 결과는 문헌과 일치했으며 동형 특이적 RAR 변조에 대한 반응으로 미토콘드리아 네트워크 행동의 추가 특성화를 허용했습니다.
이 새로운 방법론은 전체 뉴런 미토콘드리아 네트워크의 빠르고 검증된 특성 분석을 가능하게 할 뿐만 아니라 신경과학 분야에 적용하기 위한 필수 기능인 축삭돌기와 세포체 미토콘드리아를 구별할 수 있게 해줍니다. 또한, 이 프로토콜은 속효성 치료법을 사용하는 실험에 적용할 수 있어 치료 전후에 동일한 세포를 이미징할 수 있어 신경 과학 분야를 초월합니다.
Introduction
세포 미토콘드리아는 모든 생리적 상태의 중심에 있으며, 세포 미토콘드리아의 항상성(유사분열)과 행동에 대한 철저한 이해는 암 및 알츠하이머병을 포함한 광범위한 질병에 대한 약리학적 치료법을 식별하는 데 가장 중요합니다 1,2.
미토콘드리아는 에너지 항상성, ATP 생성, 칼슘 완충 및 ROS 조절에 중요한 세포 역할을 하며, 분자 샤페론은 에너지 의존적이기 때문에 단백질 항상성을 유지하는 데 유사분열은 필수적입니다3. 이를 위해서는 세포의 요구를 효율적으로 충족하기 위해 지속적이고 역동적인 네트워크 변조 및 적응이 필요하며, 미토콘드리아 수송은 다양한 신호 경로에 의해 조절됩니다. 이전 연구에서는 이러한 경로 중 하나인 레티노산 수용체(RAR)4,5에 대해 설명했습니다. 레티노산(RA)은 RAR 활성화를 통해 축삭돌기 및 신경돌기 성장을 촉진합니다. 생쥐의 일차 피질 뉴런에서 RAR-β의 활성화는 신경돌기의 미토콘드리아 성장, 속도 및 이동성을 촉진한다6.
미토콘드리아 네트워크 적응성과 역동성을 고려할 때, “실시간”으로 유사분열을 평가할 수 있는 가능성은 에너지 항상성을 조사하는 것뿐만 아니라 단백질 항상성, 세포 건강, 증식 또는 신호 전달을 조사하는 데에도 필수적입니다. 유사분열을 평가하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 형광 염료 또는 마커를 사용하여 미토콘드리아를 강조 표시한 후 컨포칼 현미경 검사와 온도 및/또는CO2 조절을 허용하는 특정 현미경 설정에 의존합니다7. 이러한 유형의 실험 설정에서는 한 번에 하나의 실험 반복실험을 수행해야 합니다. 다양한 처리의 실험적 반복 외에도 대부분의 실험에는 일련의 시점에 일련의 초점면(z-스택)이 기록되는 일련의 초점면(z-스택)과 함께 기술적 복제(플레이트당 두 개 이상의 위치가 이미지화됨)가 있어야 한다는 점을 고려해야 합니다. 따라서 1개의 대조군과 2개의 처리를 3회 반복하고 플레이트당 5개의 이미징 위치와 15개의 시점을 사용하는 실험 설계에서는 225개의 스택을 처리해야 합니다. 전통적으로 살아있는 미토콘드리아의 비디오는 카이모그래프를 플로팅하여 분석했으며, 이 그래프는 컴퓨터 도구에 의존하는 경우에도 광범위한 수동 입력이 필요한 시간 소모적인 프로세스에서 개별적으로 분석되었습니다8.
최근 라이브 셀 2D 및 3D 타임랩스 파일에서 미토콘드리아의 자동 분할 및 추적을 가능하게 하는 알고리즘이 설명되었습니다(9). 다른 정량화 기법을 사용할 수 있으며, 모두 한계가 있습니다10. 자동화된 오픈 소스 애플리케이션인 Mitometer는 시간 경과 및 미토콘드리아 역학 분석에 특히 적합하며 사용자 입력이 적습니다. 이 응용 프로그램은 기존의 다른 MATLAB 기반 도구에 비해 여러 가지 장점이 있는데, 최대 13개의 서로 다른 파라미터를 사용하여 개별 TIF 스택을 자동으로 처리할 수 있다는 점으로, 특히 신경 과학에서 흥미로운 점은 핵 주위 미토콘드리아와 원격 핵 미토콘드리아를 구분하기 때문입니다.
그러나 위에서 설명한 것과 같은 실험의 경우 이러한 13개의 매개 변수를 225개의 스택에 적용하면 2,925개의 개별 출력 파일이 생성됩니다. 이를 위해서는 4개의 개별 컴퓨터 입력이 필요하며, 모든 출력 파일을 다운로드하는 데 최대 10,000개 이상의 수동 입력이 필요합니다. 대규모 실험 설계의 경우 이로 인해 각 파일 및 데이터 통합에 대한 분석에 불필요하게 시간이 많이 소요됩니다. 여기에서는 신속한 파일 분석을 가능하게 하는 일상적인 최적화를 제시하여 문서 읽기 및 데이터 처리를 크게 줄이고 기존 도구의 출력과 일치하는 정의된 방식으로 데이터를 분석합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
라이브 셀 이미징은 고도의 컴퓨팅 처리가 필요한 대용량 파일을 생성하지만, 최신 도구조차도 처리하려면 광범위한 수동 입력이 필요합니다. 이 루틴 최적화는 Mitometer에서 미토콘드리아 분석 프로세스를 단순화하는 데 중점을 두는데, 이 도구는 사용자 입력과 데이터 출력 간에 매우 좋은 균형을 제공하기 때문입니다. 미토콘드리아 이미지 분석을 위한 다양한 도구 간의 포괄적인 비교는 이전?…
Divulgaciones
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이미지 획득은 PPBI(Portuguese Platform of BioImaging): POCI-01-0145-FEDER-022122의 노드인 iBiMED의 LiM 시설에서 수행되었습니다. 이 연구는 FCT (EXPL/BTM-SAL/0902/2021) LCF(CI21-00276), Fundação para a Ciência e Tecnologia of the Ministério da Educação e Ciência (2020.02006.CEECIND)의 DT 보조금, ATG-The Gabba Alumni Association의 VP 보조금 및 Institute for Biomedicine-iBiMED의 Aveiro 대학의 지원을 받았습니다.
Materials
| AM580 | Sigma-Aldrich | A8843 | |
| BDNF | Thermo-Fisher | RP8642 | |
| BMS493 | Tocris Bioscience | 3409 | |
| CD2314 | Tocris Bioscience | 3824 | |
| Ch55 | Tocris Bioscience | 2020 | |
| Foetal Bovine Serum | Thermo-Fisher | 10270106 | |
| GraphPad Prism v4.0 | GraphPad Software, La Jolla | n/a | |
| Ham’s F12 Nutrient Mix | Thermo-Fisher | 21765029 | |
| MATLAB R2022a | MathWorks | n/a | |
| Minimal Essential Medium | Thermo-Fisher | 31095 | |
| Nunc Glass Bottom Dishes | Thermo-Fisher | 150680 | |
| Phosphate Buffer Saline Solution | Thermo-Fisher | 28372 | |
| Retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| TMRM | Thermo-Fisher | T668 | |
| Zeiss LSM 510 | Carl Zeiss | n/a | Equiped with live-cell imaging culture chamber and 63x oil immersion objective |
Referencias
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